Nanolive 实验准备 Protocol（中文翻译 + 分析拆解）
文档类型：Nanolive 官方样品制备 SOP
原始制造商：Nanolive SA（瑞士洛桑）— www.nanolive.ch
文档结构：6 章节 / 13 页 / 2 张图（封面 + 附录 RI 表）
一、本 Protocol 解决什么问题？🧪
Nanolive 的 3D Cell Explorer + STEVE 拿到的是高质量 RI 折射率数据，但前提是样品制备符合规范。任何样品制备不当都会导致数据失败——光路衰减、信号模糊、分割漂移都是常见后果。
本 Protocol 给客户/操作人员一步一步的样品制备 SOP，确保：
- ✅ 设备运行环境正确（避免水雾/振动）
- ✅ 样品耗材兼容（玻璃底是硬性要求）
- ✅ 细胞汇合度合理（< 80% 为佳）
- ✅ 成像介质折射率匹配（RI 1.33-1.44）
- ✅ 固定/活细胞操作规范化（避免甲醇固定）
- ✅ 样品清洁度达标（无碎片/指纹/残留物）
二、实验设备所需安装环境 🏠
2.1 设备摆放（必读）
| 项目 | 要求 |
|---|---|
| 空间 | ≥ 1 m² 平台（建议略大于此） |
| 台面 | 水平、坚实、抗震 |
| 周边 | 避免离心机等大振动设备 |
| 环境温度 | 建议 25°C 以上（防止工作站/镜头形成水雾） |
2.2 暗室（可选）
- 荧光成像：暗室更好（提高荧光信噪比）
- 没有暗室：也能拍到（但质量受影响）
2.3 CO₂ 气体（可选）
- 有 CO₂ 气瓶/气路：延长活细胞观察时间
- 没有 CO₂：也能观察（短期）
三、样品制备 5 条注意事项 ⚠️
任何一条不遵守都会显著影响图像质量。
- ⚠️ 细胞必须接种在玻璃底（如盖玻片或玻璃底培养皿）——塑料底不可用
- ✅ 适用任何真核/原核细胞 + 薄组织切片（5-10 μm）
- ⚠️ 细胞汇合度有限制：单层/多层都可，但不能超过可观察最大厚度 30 μm
- ⚠️ 培养基 RI 应接近活体物质（≈ 1.35）—— PBS 最佳；含酚红的也能用但需控制液量
- ⚠️ 光学表面要干净（镜头、细胞工作站上盖、培养皿支架）
四、规格概述 📋
4.1 规格表 1 — 载玻片
| 条件 | Nanolive 规格 | 备注 |
|---|---|---|
| 盖玻片厚度 | 170 ± 20 μm | 推荐 Hirschmann（hirschmannlab.com） |
| 可观察样品最大厚度 | 30 μm | 建议 5-10 μm |
| 不要石蜡包埋 | — | 石蜡会干扰 |
| 水基培养基 RI | 1.33-1.44 | — |
4.2 规格表 2 — 培养基
| 条件 | 规格 | 备注 |
|---|---|---|
| 玻璃底培养皿直径 | ≥ 35 mm | 完整 ibidi 兼容列表见 nanolive.ch/wp-content/uploads/nanolive-ibidi-labware.pdf |
| 可观察样品最大厚度 | 30 μm | 同表 1 |
| 光学透明培养基最大体积 | 1.5 mL 左右（35 mm 培养皿） | 取决于培养皿光学特性 |
| 轻微光散射培养基最大体积 | 1 mL 左右（35 mm 培养皿） | 已验证：Agarose hydrogel 可行 |
五、样品制备 — 耗材 + 介质 + SOP 🔬
5.1 兼容耗材
厂家推荐 + 国产验证过的耗材
5.1.1 显微载玻片和盖玻片
- 底部厚度 130-170 μm
- 推荐载玻片：Slide SuperFrost（BioSystems）
- 推荐盖玻片：Hirschmann（hirschmannlab.com）
- 国产可选：biosharp 部分共聚焦培养皿经实验验证后也可行
5.1.2 ibidi 实验室器皿（完整清单）
| 类型 | 型号 |
|---|---|
| Multi-well chambers | µ-Slide 2 Well / µ-Slide 18 Well – Flat |
| Channel Slides | µ-Slide I Luer / y-shaped / III 3in1 / III 3D Perfusion / VI – Flat / VI 0.5 Glass Bottom |
| Microscopy dishes | µ-Dish 35 mm low / high / high Glass Bottom / low Grid-500 / high Grid-500 / high Grid-500 Glass Bottom |
拍摄 3D 图像过程中请把上盖打开（避免上盖干扰光路）
5.2 细胞汇合度
- 没有明确限制，但单细胞/低汇合度通常效果最佳
- 单层/多层细胞可观察，但不能超过 30 μm 最大厚度
- 超过厚度限制 → 低质量信号警报或故障消息
5.3 成像介质（核心章节）
5.3.1 推荐的培养基介质
| 介质 | RI 值 | 适用 |
|---|---|---|
| PBS 溶液 | 1.334 | ✅ 通用首选 |
| FluoroBrite DMEM（Thermo A1896701） | 1.33+ | 活细胞成像专用 |
| Tris 缓冲液 | 1.33+ | OK |
| 含酚红的培养基 | 1.33+ | ⚠️ 仅实验验证可行（不推荐） |
⚠️ 关键限制：
- 液面高度不能超过培养皿高度的一半（过高会影响图像采集质量）
- 植物/真菌细胞的 RI 通常超过 1.44，需要用甘油 + PBS 调匹配
- 甘油浓度提升对活细胞有毒性
5.3.2 显微载玻片成像介质（封固剂）
| 封固剂 | RI 值 | 备注 |
|---|---|---|
| PBS 溶液 | 1.334 | ✅ 首选 |
| Fluoromount-G 荧光封片剂（Southern Biotech） | 1.389 | 荧光封片 |
| ibidi 封固剂 | 1.42-1.44 | — |
| 75% 甘油/蒸馏水 | 1.44 | — |
| ProLong® Gold Fresh | 1.39 | — |
| ProLong® Gold Cured 1 天 | 1.40 | — |
| ProLong® Gold Cured 4 天 | 1.44 | — |
⚠️ OCT/石蜡不完全透明，会干扰采集——装片前必须移除
⚠️ 非水基封固剂一般不兼容
5.4 样品制备和成像的 4 类通用规则
5.4.1 贴壁活细胞或固定细胞（ibidi 35 mm 低边框培养皿）
对固定细胞（7 步）：
- 包被最少量的包被材料（ibidi AN08 协议）
- 按 ibidi 操作规程种细胞
- 培养至所需汇合度（建议 < 80%）
- 用温热（37°C）PBS 清洗，30 秒内进入下一步（降低细胞应激）
- 用 1 mL 4% PFA 固定，室温 15 分钟，PBS 洗 3 次
- ⚠️ 禁止用甲醇固定！
- 用建议的培养基（封固剂）覆盖
- 成像或 4°C 保存
对活细胞（5 步）：
1-3 同固定细胞
4. 用预热的活细胞成像介质更换
5. 成像或 37°C 培养箱保存
⚠️ 移开盖子后可直接在培养皿中观察
5.4.2 非贴壁细胞（细菌、酵母、红细胞等）
- 加推荐用量的培养基介质
- 在皿中央加几滴悬浮细胞
- 沉淀等待 10 分钟（这阶段采集质量差，失败率高）
- 尽可能减少振动（让细胞在底部稳定）
- 成像
固定辅助剂（防漂移）：
- Protoslo：鞭毛虫/纤毛虫
- Cell-tak：通用
- Poly-D-Lysine：悬浮血细胞
5.4.3 固定细胞（盖玻片上，11 步）
- 无菌盖玻片放在培养皿底部
- 包被
- 种细胞
- 培养至所需汇合度
- 温热 PBS 清洗，30 秒内进入下一步
- 2 mL 4% PFA，室温 15 分钟
- 2 mL PBS 洗 3 次
- 成像垫片 + 一滴封固剂
- 从 PBS 取出盖玻片，纸巾侧面吸干（警告：纸巾不要放在上面）
- 盖玻片放在成像垫片上（细胞面朝载玻片）
- 成像或 4°C 保存
密封方法（2 选 1）：
- ✅ 推荐：成像垫片胶带（SS1X9 SecureSeal，Grace Biolabs #654002）
- ⚠️ 第二选择：指甲油（经常溢出到盖玻片上）
5.4.4 组织切片
关键条件：
- ⚠️ OCT/石蜡不完全透明 → 装片前移除
- ✅ 5-10 μm 切片最佳（最大厚度 < 30 μm）
- ✅ 含水封固剂，RI 1.33-1.44
- ⚠️ 倒置观察（盖玻片朝向物镜）
六、样品清洁度 🧹
样品清洁度是保证图像质量的关键。
由于旋转光源系统，光束可能穿过碎片（漂浮的/不在焦面上的）：
- 盖玻片：用擦镜纸（Thorlabs #MC-50E）+ 几滴乙醇轻轻擦拭（去除灰尘/指纹，不留棉绒）
- 玻底培养皿：PBS 洗 3 次去除死细胞/碎片，再加安装介质 + 同擦镜纸清洁外表面
⚠️ 细胞尺寸应小于显微镜视场和景深（具体规格见用户手册或 nanolive.ch/hardware/）
七、配件 — 活细胞工作站 🧫
Nanolive 的 3D Cell Explorer + 活细胞工作站 配套使用，可在生理环境条件下做数天的无侵害 4D 长时间成像。
工作站的核心功能：
- 温度控制
- 湿度控制
- pH 值控制
💡 详细合作伙伴产品列表见 nanolive.ch/accessories/
八、附录 — 甘油/PBS 折射率（RI）对照表 📊
图1 — 甘油/PBS 溶液的 RI 值对照曲线（横轴：甘油浓度 %；纵轴：折射率 RI）。这条曲线让客户能精确配制特定 RI 值的成像介质。
- 甘油参考：Sigma Aldrich G5516
- 测量仪器：AR4 系列阿贝折射计（KRUSS OPTRONIC）
💡 使用要点：
- 找目标 RI → 用曲线查甘油浓度 → 配制溶液
- 甘油浓度提升对活细胞有毒性 → 仅在必要时使用
- 哺乳动物细胞 RI 范围 1.33-1.44（大多数情况 PBS 即可）
九、销售视角的客户问答 💼
| 客户问题 | 答案 |
|---|---|
| "我的培养皿是塑料底，能用吗？" | 不能。必须是玻璃底。biosharp 部分共聚焦培养皿经实验验证后可行。 |
| "我的细胞汇合度很高（> 80%），能用吗？" | 能，但不能超过 30 μm 厚度。建议 < 80% 汇合度获最佳质量。 |
| "用甲醇固定行吗？" | **绝对不行！**用 4% PFA 固定（PFA = 多聚甲醛）。 |
| "培养基有酚红会不会干扰？" | 会轻微干扰，但能成像。建议用 FluoroBrite DMEM 或 PBS。 |
| "我需要甘油调 RI 吗？" | 一般不需要（哺乳动物细胞 RI ≈ 1.35）。只有植物/真菌等高 RI 样品才需要。 |
| "切片厚度多少合适？" | 5-10 μm 最佳，最大 < 30 μm。 |
| "要做几天的活细胞成像，怎么办？" | 配 Nanolive 推荐的活细胞工作站（温度 + 湿度 + pH 三控）。 |
| "推荐什么耗材？" | ibidi µ-Dish 35 mm 系列最常用（厂家验证）。盖玻片用 Hirschmann 170 μm。 |
| "我想做悬浮细胞/血细胞，怎么固定？" | 用 Protoslo（鞭毛虫） / Cell-tak（通用） / Poly-D-Lysine（血细胞）。 |
十、关键资料链接 🔗
- Nanolive 官网：http://nanolive.ch
- Nanolive 配件页：http://nanolive.ch/accessories/
- Nanolive 硬件规格：http://nanolive.ch/hardware/
- Nanolive ibidi 兼容耗材清单：http://nanolive.ch/wp-content/uploads/nanolive-ibidi-labware.pdf
- ibidi 培养皿包被 AN08：http://ibidi.com/img/cms/support/AN/AN08_Coating.pdf
- ibidi 35 mm low dish 操作规程：http://ibidi.com/img/cms/products/labware/open_standard/D_801XX_Dish_35mmlow/IN_8013X_Dish35mm_low.pdf
- ibidi 玻底 35 mm 培养皿：http://ibidi.com/labware/185-glass-bottom-dish-35-mm.html
- Hirschmann 盖玻片：http://www.hirschmannlab.com/
- 客户注册 + 软件下载：https://www.nanolive.ch/register
📥 原文 PDF 链接
📄 Nanolive 实验准备 Protocol PDF（中文版，13 页，576 KB）
联系人｜李东伟
📞 18045130660
🌐 主页：https://www.biokingdom.top