EVE ANALYTICS 软件用户手册（中文翻译 + 分析拆解）
产品：Nanolive EVE ANALYTICS（3D Cell Explorer 配套分析软件）
原始手册：Nanolive SA（瑞士洛桑）— www.nanolive.ch
手册结构：11 章节 / 21 页 / 19 张图（本文选取 17 张核心图）
一、这是什么？🤔
EVE ANALYTICS（EA） 是 Nanolive 的数字染色分析软件，专门处理 3D Cell Explorer 输出的 .xvol/.seg 文件。功能核心：
- 细胞分割（基于折射率 RI 的多阈值分割）
- 形态学指标提取（面积/周长/紧凑度/椭圆度等 13 项）
- 干物质（dry mass）定量测量（基于 RI → 干物质换算公式）
- 批次分析（基于图像聚类 — Clustering — 自动分组 + 灵敏度选择）
- CSV/TIFF 批量导出（每个分析的指标 + MIP + 蒙版 + 叠加层）
1.1 与 3D Cell Explorer / STEVE 的关系
| 软件 | 阶段 | 角色 |
|---|---|---|
| 3D Cell Explorer | 物理采集 | 硬件 — 产生 .xvol 原始数据 |
| STEVE | 数字染色 | 实时 — 在采集同时做 RI 数字染色 + 单细胞交互探索 |
| EVE ANALYTICS（EA） | 批量分析 | 离线 — 在采集完成后做大规模、自动化的形态学/干物质定量 |
为什么需要 EA？STEVE 是艺术家工具（看 + 染色），EA 是科学家工具（批量处理 + 统计 + 导出）。
1.2 工作流总览
.xvol 原始数据
↓
EA 导入 → ANALYZE 按钮 → 生成 .seg 文件
↓
设置页面（选协议 + 参数 + 组）
↓
聚类（自动分组相似图像） + 预览构建
↓
灵敏度参数选择
↓
可视化页面（看结果 + 调组 + 看指标）
↓
导出（CSV + TIFF）
二、采集结束后 — 第一步 ▶️
图1 — 在 STEVE/EA 界面上找到 ANALYZE 按钮，点击后会生成 .seg 文件（包含分析所需的全部数据）。这个 .seg 文件可以传输到其他 PC 上继续分析（不需要把原始数据带过去）。
三、设置页面 ⚙️
图2 — 设置页面的 6 个核心区：①分析名称（不要用特殊字符）；②协议；③参数；④循环长度/频率；⑤采集分组（不可改）；⑥PLAYER 选项卡预览。只有填好 ①②③ 才能点 GO TO PREVIEW。
3.1 协议与参数选择（表 1）
| 协议 | 效果 | 参数 | 适用场景 |
|---|---|---|---|
| 标准分析 | 分割细胞 + 提取形态学/功能指标 | Compact/Discrete（紧凑/离散） | 小细胞、致密细胞（红细胞、网柄菌 Dictyostelium） |
| Spread/Extended（摊开/延展） | 大多数贴壁细胞（贴壁培养的标准哺乳动物细胞） |
四、图像聚类（CLUSTERING）🔀
EA 的核心智能化特性 — 自动分组相似图像。
4.1 科学背景
为了执行相关量化，重要的是以足够灵敏度捕获细胞信号以包括所有细胞细节；但又不能过多以排除背景信号。
EA 通过多分割阈值引导单独细胞分割。但用户需要为每个实验选最合适的灵敏度。
两步流程：
- 聚类（Clustering）：把"相似"图像分组（无关位置/时间点）
- 灵敏度选择：为每个聚类独立调参
4.2 聚类定义
- "相似" = 最大强度投影（MIP）上的相似折射率（RI）信号
- 聚类目的：①优化计算时间；②让用户体验更轻松；③提供更高的分割质量
五、第 1 步：聚类（CLUSTERING）🔢
图4 — 4 组图像：2 组代表分布的极限 + 2 组代表中间。每个聚类可保留（keep）或丢弃（discard），软件显示每个组占全部图像的百分比。
5.1 3 个聚类示例
图5 — 三种典型聚类情况：5a 失焦（建议丢弃）/ 5b 有较好生物学意义（建议保留）/ 5c 被碎片污染（建议丢弃）。用户根据每组的代表性决定去留。
六、预览页面的构建 ⏳
图6 — 聚类选好后开始构建预览，显示预估剩余时间。预览时长取决于采集文件大小 + 工作站算力。10×10 网格扫描可能需要相当长时间才能提供完全重建后的预览（小时级）。
七、灵敏度参数的选择 🎚️
图7（左侧）+ 图8（右侧）— 预览页面的灵敏度参数调节器。如果初始分割预览不满意，可点 "refine（细化）" 或 "extend（扩展）" 按钮动态调整灵敏度值数量。为每个聚类选好灵敏度后，单击 START ANALYSIS。图8 显示分析预计所需时间。
八、可视化页面 📊
图9 + 图10 — 分析完成后进入可视化页面，三步操作：①定义分析组；②可视化延时成像 + 评估分割质量（图10 PLAYER 选项卡提供对比度/亮度/MIP 蒙版透明度调节）；③探索实验分析结果。
8.1 分析组定义
- 分析组独立于采集组——要创建不同于采集组的分析组，必须先删除采集组
- 最多 12 个组
- 创建组 3 种方式：①拖放区域到要选择的孔；②双击孔；③单击"create a group"再单击孔
- 可编辑组（删除不需要的孔），可创建不相邻孔的组
8.2 PLAYER 选项卡（图10）
- 对比度调整：更改显示的 RI 图像对比度（不影响原始数据）
- 亮度调整：同上
- MIP 蒙版覆盖：可改蒙版透明度
九、EA 所展示的指标 📐
这是 EA 的灵魂 —— 13 个形态学/定量性/全局性指标。
9.1 指标全景
图12 — EA 中显示的所有指标的公式与参数示意图：RI（MIP）、Segmentation mask、Area、Perimeter、Mean squared distance、Bounding box、Principal axes。
9.2 13 个指标的完整定义
形态学指标
| 指标 | 单位 | 定义 |
|---|---|---|
| Area（面积） | μm² | ROI 中的像素数 × 0.04 |
| Perimeter（周长） | μm | 像素总数 × 0.2 |
| Compactness（紧凑度） | - | (距质心的均方距离)/面积（图13） |
| Extent（范围/延展度） | - | 面积 / 边界框面积（图14） |
| Ellipticity（椭圆度） | - | 椭圆焦点距 / 长轴长度（图15，0=圆，1=线段） |
| Form factor（形状系数/圆度） | - | (4π × 面积) / 周长² |
定量性指标
| 指标 | 单位 | 定义 |
|---|---|---|
| Mean RI（RI 均值） | - | RI 的整体平均值 |
| Average dry mass density（平均干物质密度） | pg/μm³ | 平均干物质估算 |
| Dry mass（干物质） | pg | 总干物质估算 |
| Granularity（粒度） | - | 以 5×5 像素刻度测量的 RI 变化（反映细胞器组织状态） |
全局性指标（按视野汇总）
| 指标 | 单位 | 定义 |
|---|---|---|
| Cell count（细胞计数） | 数量 | 目标数量 |
| Confluency（汇合度） | % | (检测目标总面积) / (视野面积) |
| Total dry mass（总干物质） | pg | 检测目标总面积的总干物质 |
9.3 紧凑度、范围、椭圆度的几何含义
图13 — 紧凑度 = (距质心的均方距离)/面积。计算方式：分割细胞后（A），把一个与此细胞同面积的圆放在细胞中心（B），测量蒙版周长到圆周长的每个像素距离（C），计算均方距离并除以圆的面积。
- = 1 = 圆形细胞
- 较高 = "尖形"细胞（如多个轴突的神经元）
图14（范围/延展度）：包围细胞的边界框中同时也在区域内的像素占比。=1 圆形/线形；≈0 正在扩散。
图15（椭圆度）：椭圆焦点距与长轴长度之比。0=圆；1=线段。参照与分割细胞具有相同二阶矩的椭圆。
十、干物质（Dry Mass）测量 ⚖️
EA 独家能力 —— 基于 RI 的非标记干物质定量。
10.1 物理原理
干物质 = 细胞内容物中除去水的含量总量（蛋白质、脂质等）。全息层析测得的 折射率（RI） 与干物质有直接关系（参考 P.A.Sandoz et al., PLOS, 2019）。
10.2 公式
测得 RI = 水的 RI × [α × C + 1]
其中 C 是干物质（单位 g/dL）
重新组织：
C = [(测得 RI / 1.33) - 1] × (1.33 / 0.002)
参数：
α = 0.002 / 1.33
水的 RI = 1.33
10.3 三种干物质定义
| 指标 | 适用场景 |
|---|---|
| Dry mass（干物质） | 单细胞 — 干物质含量 |
| Total dry mass（总干物质） | 整组 — 所有细胞干物质之和 |
| Average dry mass density（平均干物质密度） | 平坦细胞（用 20 层 -5~+15 断层窄投影近似平均投影）— pg/μm³ |
十一、导出所有结果 💾
图16 — EXPORT ALL RESULTS 按钮（第一次点会有警告："你还没有任何导出结果"——可忽略）。
11.1 默认导出 4 类文件
| 文件类型 | 格式 | 说明 |
|---|---|---|
| MIP | TIFF 堆栈 | 每个位置的最大强度投影 |
| 蒙版（Mask） | TIFF 堆栈 | 每个分析位置的分割蒙版 |
| 叠加层（Overlay） | TIFF 堆栈 | MIP + 蒙版叠加 |
| 指标 | CSV | 数字化的分析结果 |
11.2 每次分析创建 3 个 CSV
CSV 1 — 细胞指标（按 well / cycle / cell index 排序）
- Cell area μm²
- Cell compactness
- Cell area %
- Cell ellipticity
- Cell perimeter μm
- Mean RI
- Cell circularity
- Average dry mass density pg/μm³
- Cell extent
- Dry mass pg
CSV 2 — 细胞指标统计（按 well / cycle 排序，提供统计量）
| 统计量 | 含义 |
|---|---|
| 平均值 | Mean |
| 标准偏差 | 组内数据离散度 |
| 变异系数（CV） | 标准偏差/平均值（平均值为正时） |
| 2.5 / 25 / 75 / 97.5 分位数 | 分布形状 |
每个指标计算上述 4 个统计量。
CSV 3 — 视野范围内指标（按 well / cycle 排序）
- Cell count
- Confluency %
- Total Dry mass pg
十二、可视化页面的绘图管理按钮 🎨
可视化页面提供 8 个绘图管理按钮：
| # | 按钮 | 功能 |
|---|---|---|
| ① | Zoom | 选择当前图像的子范围（x 和/或 y） |
| ② | PAN | 在图像上导航（缩放后） |
| ③ | Zoom in / out | 自动变焦 |
| ④ | Reset Axes | 重置轴 |
| ⑤ | Toggle Spike Lines | 报告悬停关注点在轴上的位置 |
| ⑥ | Download plot as png | 截图 |
| ⑦ | Show legend | 显示/隐藏图例 |
| ⑧ | Show standard deviation | 提供组内离散信息 |
十三、FAQ ❓
5 个常见问题，官方答案如下：
| Q | A |
|---|---|
| 能否通过只选择几个指标来加速分析？ | 不。编程是对整个数据集分析处理的。 |
| 如果数据集未完全重建，能否执行分析？ | 否。必须完全重建数据集。 |
| 能改写或覆盖已有的分析结果吗？ | 否。重新启动会创建第二个分析结果（保留旧的）。 |
| 如果丢失了 .seg 文件，能否重做分析？ | 是。重新用原始数据创建 .seg 即可。 |
| 能否对同一个 .xvol 保存两个不同分析结果？ | 能。可保存任意数量。 |
十四、EVE ANALYTICS 与 9X Bio 产品组合的定位 🎯
14.1 三大产品互补
| 维度 | CelVivo ClinoStar | 3D Cell Explorer + STEVE + EVE ANALYTICS |
|---|---|---|
| 原理 | 旋转悬浮培养 | 全息层析 + 数字染色 + 批量分析 |
| 时间维度 | 数天-数周 | 0.5 fps 实时 + 离线批量 |
| 数据读出 | 球体形态（肉眼/染色） | 13 项形态学指标 + 干物质定量（无标记） |
| 侵入性 | 无 | 无（光毒性极低） |
14.2 典型场景
- 药筛 + 形态学定量：CelVivo 培养球体 → EVE ANALYTICS 监测加药后形态变化（无标记、无需切片、批量分析 13 项指标）
- 细胞质量控制：3D Cell Explorer 采集 → EVE ANALYTICS 出 13 项指标 + 干物质（用作批次 QC）
- 干物质定量实验：直接走 EA，比传统 qBSA（quantitative buoyant mass）/ 显微干涉测量法更简单
14.3 销售视角的客户常见 Q&A
| 客户问题 | 答案 |
|---|---|
| "需要标记细胞吗？" | 不需要。基于折射率（RI）的无标记分析。 |
| "能同时跑多少样本？" | 取决于实验设计 — 最多 12 个分析组 × 任意循环数。 |
| "数据格式？" | CSV + TIFF。直接进 Excel/GraphPad Prism/ImageJ。 |
| "能加自定义指标吗？" | 不能。EA 内置 13 个指标，不开放自定义。 |
| "干物质测量准吗？" | 基于 P.A.Sandoz 2019 PLOS 验证，与 qBSA 高度一致。 |
| "需要 STEVE 吗？" | 需要 — EA 是 STEVE 的离线分析扩展，必须先在 STEVE 采集 + ANALYZE 生成 .seg 文件。 |
| "分析速度？" | 取决于采集大小 + 工作站算力（GPU 加速）。10×10 网格扫描小时级。 |
| "计算机要求？" | 同 3D Cell Explorer（NVIDIA 独显 8GB 是硬门槛）。 |
十五、关键资料链接 🔗
- Nanolive 官网：http://nanolive.ch
- Nanolive 应用案例：http://nanolive.ch/applications
- 干物质公式参考文献：P.A.Sandoz et al., PLOS, 2019
- 客户注册 + 软件下载：https://www.nanolive.ch/register
- EVE Analytics 详细教程：联系供应商获取
📥 原文 PDF 链接
📄 EVE ANALYTICS 软件用户手册 PDF（中文版，21 页，1.4 MB）
联系人｜李东伟
📞 18045130660
🌐 主页：https://www.biokingdom.top