Nanolive 实验图伪彩上色训练（中文翻译 + 分析拆解）
文档类型：Nanolive 官方数字染色训练手册
原始制造商：Nanolive SA（瑞士洛桑）— www.nanolive.ch
文档结构：5 章节 / 20 页 / 21 张配图
一、为什么需要数字染色？🔬
活细胞是透明的——在传统显微镜下没有足够的对比度。但细胞有一个很有价值的自然物理标记：折射率（RI）。RI 展示介质如何影响光的传播，由于组成不同，细胞内部的折射率略有差异。
Nanolive 的 3D Cell Explorer 可逐点测量 RI，并提供给定体积的 3D 重建。基于这一信息，细胞器之间/细胞之间的差异可被区分——这要归功于**数字染色（digital stain）**过程。
本文档是一个实用型训练指南，包含：
- ✅ STEVE 软件数字染色详细步骤程序
- ✅ 理论解释（折射率 + 折射率梯度）
- ✅ 染色操作实例
- ✅ 黄金建议（改善染色效果，避免典型错误）
💡 所有训练数据可在 nanolive.ch/downloads/data/ 下载，或从 STEVE 的"帮助 > 获取更多数据"菜单获取。
二、STEVE 软件数字染色 8 步流程 🎨
配合图 1a-1l 实操截图，按部就班即可完成单细胞/亚细胞结构的数字染色。
2.1 步骤总览
| 步骤 | 操作 | 配图 |
|---|---|---|
| 1 | Z 轴堆栈面板中选择信息丰富的平面 | 图1b |
| 2 | 点击"+"号添加新染色 | 图1c |
| 3 | 选择命名（可选） | 图1d |
| 4 | 选择颜色 | 图1e |
| 5 | 在 RI 图层画感兴趣区 | 图1f |
| 6 | 染色叠加在 RI 图层 | 图1g |
| 7 | 操控染色（不透明度/边部柔和度/移动/形状） | 图1h |
| 8 | 添加其他染色（重复 1-7） | 图1i |
2.2 STEVE 软件界面总览
图1a — STEVE 软件界面全景：左侧 RI 图层 Z 轴堆栈面板，右侧 D-stain 数字染色面板视图（RI × RI 梯度二维空间），下方染色选取区 + 按钮区。
2.3 详细操作
步骤 1 — 选择 Z 平面
图1b — 按住鼠标左键在 RI 图层上下拖动，或拖动面板下方的 "Slices slider"，观察细胞在不同 Z 层面的形态。选最有信息量的一层作为画图起点。
步骤 2 — 添加新染色
图1c — 在 D-stain 面板的染色选取区点击"+"号，添加一个新染色。
步骤 3 — 选择命名（可选）
图1d — 点击黑-灰命名输入条，输入您想要的命名（如"细胞核"、"线粒体"）。
步骤 4 — 选择颜色
图1e — 点击选择您想要的颜色。可选：拖动鼠标精确选择饱和度/明度。
步骤 5 — 在 RI 图层画感兴趣区
图1f — 在所需感兴趣区上单击和/或拖动鼠标。光标下的像素在面板视图中发光——释放鼠标时，软件根据选定的像素计算染色范围。可选：用鼠标滚轮放大 RI 图层。
步骤 6 — 染色叠加
图1g — 现在染色显示在 D-stain 面板视图，并叠加在 RI 图层。可选：移动 Overlay 滑块调整彩色图像在 RI 图层上的权重。
步骤 7 — 操控染色
图1h — 4 类染色操控：
- a. 不透明度（Opacity 滑块 或 按住鼠标右键上下拖动）
- b. 边部柔和度（Edge Softness 滑块 或 在染色边部按住右键上下拖动）
- c. 移动染色（在 D-stain 面板单击并拖动染色到 RI-Index 渐变空间所需位置）
- d. 改形状（选边/角点拖动）
步骤 8 — 添加其他染色
图1i — 重复 1-7 可添加多个染色（如同时染细胞核 + 细胞质 + 细胞膜 + 囊泡）。
额外 — 染色管理
图1j — 启用/禁用染色的可视化（小眼睛图标）
图1k — 删除染色（垃圾桶图标）
图1l — 更改染色颜色（双击彩色按钮或单击调色板图标）
三、什么是"折射率（RI）"和"折射率梯度"？📐
理论章节——理解数字染色的物理基础。
3.1 折射率（RI）定义
折射率 = 光在真空中的速度 / 光在该介质中的速度：
RI = c / v
c ≈ 300,000 km/s
v = 光在该介质中的速度
水的折射率 = 300,000 / 225,000 ≈ 1.33
3.2 常见介质的 RI 值（绿光 520 nm）
| 介质 | 折射率 | |
|---|---|---|
| Waters（水） | 1.333 | |
| PBS | 1.334 | |
| DMEM + 10% FBS | 1.337 | |
| Ethanol（乙醇） | 1.364 | |
| Urea（尿素） | 1.495 | |
| FluoroDish glass（荧光培养皿玻璃） | 1.525 | |
| ### 3.3 折射率梯度（ | ∇RI | ）定义 |
折射率梯度描述折射率在一个像素附近如何变化：
∇RI = √[(RI(x+1,y,z) - RI(x-1,y,z))² / (2px)² +
(RI(x,y+1,z) - RI(x,y-1,z))² / (2py)² +
(RI(x,y,z+1) - RI(x,y,z-1))² / (2pz)²]
这里
px,y,z是分辨率，RI(x±1,y±1,z±1)是相邻像素的折射率。
3.4 D-stain 面板的 4 象限理论
图2a — RI 梯度的几何含义：相邻像素 RI 差异计算。
图2b — D-stain 面板的典型 4 象限配置：
| 象限 | RI | RI 梯度 | 典型结构 |
|---|---|---|---|
| I（左上） | 低 | 高 | 细胞膜（边缘结构） |
| II（右上） | 高 | 高 | 胞内小泡（纹理带） |
| III（左下） | 低 | 低 | 背景（透明均匀） |
| IV（右下） | 高 | 低 | 细胞核（高密度类结构） |
3.5 D-stain 在 RI 图像上的应用
图2c — 在细胞折射率图像上应用 D-stain：原图（左侧）/ 应用后（右侧）的对比，染色方块在 RI × RI 梯度空间的位置决定了它在 2D 视图上的覆盖范围。
四、染色微调操作 🎛️
数字染色的 3 个核心调节维度——让染色精确对应你想要的生物结构。
4.1 位置调节
图3 — 在 RI × RI 梯度 2D 空间中移动染色方格：
- 水平移动 → 调整 RI 范围（不同生物成分有不同的 RI 范围，如细胞膜 vs 核膜）
- 垂直移动 → 调整 RI 梯度范围（边缘 vs 内部）
4.2 形状调节
图4 + 图4b — 染色方格的形状调节：
- 水平拉伸/压缩 → 控制 RI 范围宽度（对多少 RI 像素染色）
- 垂直拉伸/压缩 → 整合多少 RI 梯度变化（边缘锐利度）
4.3 不透明度和边缘柔和度
图5 + 图5b — 不透明度和边缘柔和度的调节效果。
| 参数 | 含义 | 范围 |
|---|---|---|
| 不透明度 | 彩色像素的最大强度 | 0（透明）↔ 100（不透明） |
| 边缘柔和度 | 彩色像素内强度变化的速度 | 0（平缓）↔ 100（锐利） |
图5c/d — 调节对 3D 视图的影响（顶视图 + 侧视图）：高不透明度 + 高边缘柔和度 = 平滑柔和的彩色渲染；低值 = 锐利但有颗粒感的渲染。
五、最佳染色练习（黄金建议）🏆
来自原厂的 4 条核心建议——避免典型错误。
5.1 避免成像伪影
图6a — 错误做法：染色方格与背景区域重叠 → 染色覆盖了背景，并在细胞贴壁的平面（绿线）上下扩散，3D 视图中出现成像伪影（圆圈所示）。
图6b — 正确做法：确保所有染色方格不与背景区域重叠 → 仅对有意义的样本区域进行数字染色 → 3D 视图清晰无伪影。
5.2 避免单色染色
图7 — 避免相同或相似的颜色——如果用相同颜色染不同结构，无法有效区分它们。建议用对比度高的颜色（如红+绿+蓝+黄）。
5.3 重叠染色方格
图8 — 一般来说，简单有效的染色面板包括一些可良好区分的染色方格（不重叠）。但有 2 个例外场景：
- 图8a（子染色 Sub-stain）：当一个结构在另一个更大 RI 范围的隔间内时，用子染色把证据结构置于更大隔间中（如同时染细胞器和整个细胞）
- 图8b（重叠染色 Overlap）：特定情况下，几个重叠的染色可允许放入证据区域，否则很难染色
5.4 用特定 RI 值染色（如细胞膜）
图9 + 图9b — 染色特定 RI 值（如细胞膜）的最佳方法：
- 染色方格宽度尽量窄（最小 RI 范围）
- 染色方格高度与整个面板一样高（不基于 RI 梯度区分）
- 将 不透明度和边缘柔和度参数都设置在最大水平 100——这样所有匹配 RI 的像素都会被染色
六、常见错误速查 🚨
客户实际操作中最常踩的 5 个坑：
| 错误 | 现象 | 正确做法 |
|---|---|---|
| ❌ 染色方格与背景重叠 | 3D 视图出现伪影 | 只画有意义区域，不让方格溢出到背景 |
| ❌ 用相同颜色染不同结构 | 无法区分结构 | 用对比色（红/绿/蓝/黄） |
| ❌ 染色方格包含太多像素 | 染色覆盖了不相关的结构 | 缩小染色方格宽度 |
| ❌ 不透明度/边缘柔软度值过低 | 染色看起来很淡 | 调到 80-100（默认不够） |
| ❌ 在 Z 轴选错平面 | 信息量低，染色效果差 | 选有清晰边缘结构的平面作为画图起点 |
七、销售视角的客户问答 💼
7.1 数字染色的价值
| 客户问题 | 答案 |
|---|---|
| "数字染色和荧光染色的本质区别是什么？" | 数字染色是物理参数（RI），荧光是化学标记。数字染色无标记、可定量、可区分 7 种细胞器同时；荧光只能看几个标记。 |
| "数字染色能达到共聚焦/电镜的分辨率吗？" | 不能。数字染色是基于全息层析（横向 200nm / 轴向 400nm），不能与电镜（nm 级）比较。优势是活细胞 + 无标记。 |
| "为什么 Nanolive 不直接看荧光？" | 基础版 3D Cell Explorer 仅看 RI；fluo 版叠加 3 通道荧光。但 EA 分割证明荧光分割不如 RI 分割精准——这是 EVE 技术说明的实证结论。 |
| "如何选择数字染色的颜色？" | 用对比色（红/绿/蓝/黄），避免相同或相近颜色。颜色是给操作者看的，不改变数据。 |
| "数字染色的精度受什么影响？" | ① 样品制备质量（干净/平整）；② Z 平面选择（选信息量最大的）；③ 染色方格位置（精确匹配 RI 范围）。 |
| "一个细胞可以染多少个结构？" | 理论上无限（STEVE 最多支持 7 个数字染色同时 + 3 通道荧光 = 10 个标记同时呈现）。 |
7.2 与 9X Bio 产品组合的差异化
| 维度 | CelVivo ClinoStar | 3D Cell Explorer + STEVE 数字染色 |
|---|---|---|
| 是否染色 | 否（看球体形态） | 是（数字染色 7 个结构） |
| 是否需要标记 | 否 | 否 |
| 读出 | 球体形态 + 切片染色 | RI 折射率 + 7 个数字染色 + 干物质 |
| 侵入性 | 无 | 无（光毒性极低） |
STEVE 数字染色在 9X Bio 组合中的定位：填补"无标记 + 实时 + 多结构染色"的空白。其他两家不擅长多结构无标记染色。
八、关键资料链接 🔗
- Nanolive 官网：http://nanolive.ch
- Nanolive 训练数据下载：http://nanolive.ch/downloads/data/
- STEVE 软件教程视频：从 STEVE 内的"帮助 > 获取更多数据"菜单获取
- 客户注册 + 软件下载：https://www.nanolive.ch/register
📥 原文 PDF 链接
📄 Nanolive 实验图伪彩上色训练 PDF（中文版，20 页，2.4 MB）
联系人｜李东伟
📞 18045130660
🌐 主页：https://www.biokingdom.top