BioTek 细胞成像系统 — Gen5 软件操作培训手册
BioTek（Agilent） — 显微成像系统 + Gen5 软件完整操作指南，涵盖图像采集、处理、分析全流程
标签: #细胞成像 #BioTek #Gen5软件 #高内涵分析 #自动聚焦 #图像处理 #荧光成像
一、开始之前 — 新用户五个关键步骤 🔑
1.1 Gen5 任务管理器
Gen5 任务管理器是软件的主入口，提供以下功能模块：
- Data Collection（数据采集）：手动模式和实验模式成像
- Data Analysis（数据分析）：图像处理与分析
- Protocols（方案管理）：保存和加载成像方案
- Tools（工具）：板类型定义、系统设置等
1.2 手动模式 vs. 实验模式
| 模式 | 用途 | 特点 |
|---|---|---|
| 手动模式（Manual Mode） | 快速预览、优化参数 | 实时查看图像，适合寻找最佳聚焦位置、调整曝光 |
| 实验模式（Experiment Mode） | 批量采集、标准化实验 | 可定义多个通道、焦点策略、分析步骤，适合高通量实验 |
1.3 保存 Gen5 文件
- Gen5 实验文件（.g5x）：保存实验设置和参数
- 图像数据：保存为 16-bit 灰阶 TIFF 文件
- 建议设置专用存储路径，便于后续检索和分析
1.4 板类型（Labware Definition）
Gen5 需要定义所用容器的"板底高度"，这是自动聚焦的关键参数。不同密度孔板（6 孔、96 孔、384 孔等）的板底高度差异可达 200-1000 μm。
1.5 高倍率物镜调整
当使用 40 倍和 60 倍（空气） 的高倍率物镜时，需要调整物镜上的校正环以匹配培养皿/孔板的底部厚度，确保最佳成像质量。
二、成像快速指南 📸
2.1 获取图像（Acquiring an Image）
- 打开 Gen5，进入 Data Collection
- 选择仪器和板类型
- 选择成像通道（荧光/明场/相差）
- 设置曝光时间、LED 强度、物镜倍率
- 选择孔位，点击 Read 获取图像
- 预览图像，调整参数至满意
2.2 图像预览和编辑
- 多通道叠加：可叠加不同荧光通道进行彩色合成
- 对比度调整：调整亮度和对比度以便观察
- 标注：添加比例尺、文字标注等
- 裁剪：选择感兴趣区域（ROI）
2.3 图像处理和分析
- 选择分析模块（Cell Analysis、Spot Counting 等）
- 设置细胞分割参数（主 Mask）
- 运行分析，查看结果
- 导出数据（CSV、Excel 等格式）
2.4 转换为实验模式
当手动模式参数优化完成后，可一键转换为实验模式：
- 在手动模式界面点击 Convert to Experiment
- 设置板布局（哪些孔需要成像）
- 定义重复次数和多位置采集
- 保存实验方案
2.5 其他采集选项
- 多位置采集：每孔采集多个视野
- Z 轴扫描：获取不同焦平面的图像
- 时间序列：动力学图像采集
- 多通道：同时采集多个荧光通道
2.6 最佳做法
- 使用最强信号的通道设置自动聚焦
- 细胞融合度建议 40-70%
- 设置合适的背景校正孔
- 实验前进行曝光优化
三、高级拍摄指南 🔧
3.1 优化曝光设置
除了设置 LED 强度，要获得更精确的曝光设置：
- 选择 Auto Exposure 功能
- 设置目标像素百分比（通常 35-45%）
- 系统自动计算最佳曝光时间
- 手动微调 LED 强度和曝光时间的组合
3.2 高对比度明场
高对比度明场（High Contrast Brightfield）通过特殊的光学设置增强细胞结构的对比度，适合观察未染色的活细胞。
3.3 蒙太奇成像（Montage）
蒙太奇成像将多个相邻视野拼接成一张大图，适用于：
- 观察大范围细胞分布
- 获取完整孔视图
- 细胞迁移和划痕实验分析
3.4 Z 轴连续成像（Z-Stacking）
Z-Stacking 在不同焦平面采集一系列图像，然后可：
- 选择最佳焦平面
- 生成最大强度投影（MIP）
- 进行 3D 重建
- 测量细胞厚度
3.5 动力学图像采集
- 设置时间间隔（秒/分钟/小时）
- 设置总采集时间
- 可结合环境控制（CO₂、温度）进行长时间活细胞成像
- 建议采集前 30-40 分钟让系统稳定
3.6 高倍率油镜
使用油镜（60× Oil）时：
- 在盖玻片/孔板底部滴加浸油
- 调整校正环至 0.17 mm（标准盖玻片厚度）
- 使用后立即清洁物镜
3.7 板定义和其他实验耗材
- 自定义板类型：定义孔数、孔间距、板底高度
- 支持标准 6/12/24/48/96/384 孔板
- 支持 T 型烧瓶、培养皿等非标准容器
- 较低密度的孔板（如 6 孔）建议在四个角进行 2-4 次高度测量
四、实验模式成像 🧪
4.1 创建成像实验
- 打开 Gen5，选择 Experiment Mode
- 选择仪器、板类型、方案
- 定义板布局（哪些孔采集）
- 设置每个通道的成像参数（曝光、LED、物镜）
- 设置自动聚焦策略
- 设置分析步骤（可选）
- 保存方案，开始运行
4.2 实验和方案之间的差别
- 方案（Protocol）：保存的成像和分析参数模板，可重复使用
- 实验（Experiment）：基于方案的一次具体运行，包含板布局、样品信息等
4.3 Beacons 和偏移
Beacons 是预定义的标记点，用于：
- 自动定位特定区域
- 校正板的位置偏移
- 提高多位置采集的精度
五、理解自动聚焦（Auto Focus） 🔍
5.1 自动对焦方法
Gen5 提供多种自动对焦方法：
| 方法 | 适用场景 | 特点 |
|---|---|---|
| Laser Auto Focus | 大多数样本 | 快速、精确，使用激光测量表面高度 |
| Software Auto Focus | 透明或特殊样本 | 基于图像清晰度计算 |
| Surface Probe | 不透明样本 | 物理探针接触表面测量 |
5.2 用户自定义自动对焦
- 选择参考通道（建议使用信号最强的通道）
- 设置搜索范围（通常 ±50 μm）
- 设置步长（通常 1-5 μm）
- 选择焦点算法（基于图像锐度/对比度）
5.3 激光自动聚焦
- 激光自动聚焦是最常用的方法
- 通过激光测量孔底到物镜的距离
- 设置激光强度（通常 80-100%）
- 对于弱信号样本，可降低激光强度至 35-45%，避免过曝
六、图像处理 🎨
6.1 注释工具（Annotation Tools）
- 比例尺：自动根据物镜倍率添加
- 文字标注：添加描述性文字
- 箭头和图形：标记感兴趣区域
- 日期/时间戳：记录成像时间
6.2 图像处理（Image Preprocessing）
- 背景校正：去除背景噪声
- 平场校正：修正光照不均匀
- 滤波：平滑、锐化、边缘增强
- 阈值分割：区分前景和背景
6.3 数码相差（Digital Phase Contrast）
通过算法模拟相差显微镜效果，无需物理相差环即可观察未染色活细胞的精细结构。
6.4 去卷积（Deconvolution）
去卷积算法通过数学反卷积提高图像分辨率和对比度，特别适合：
- 荧光图像
- Z-Stack 数据
- 提高信噪比
七、基础图像分析 📊
7.1 设置主 Mask 并计数（Primary Mask and Count）
主 Mask 是细胞分割的核心步骤：
- 选择分割通道（通常是荧光最强的通道）
- 设置阈值方法（自动/手动/自适应）
- 调整参数（最小/最大细胞大小、圆度等）
- 预览分割结果，调整至满意
- 运行计数
7.2 度量指标（Calculated Metrics）
Gen5 自动计算以下指标：
- 细胞计数：总细胞数、阳性细胞数
- 面积：细胞总面积、平均面积
- 强度：平均荧光强度、积分荧光强度
- 形态：圆度、长宽比、周长
- 纹理：均匀性、颗粒度
7.3 亚群分析（Subpopulation Analysis）
- 基于荧光强度阈值区分阳性/阴性细胞群
- 使用散点图或直方图可视化分布
- 设置门限（Gate）定义亚群
- 计算各亚群比例和统计指标
7.4 细胞分析详情（Cellular Analysis Details）
- 查看每个细胞的详细数据
- 导出单个细胞级别的指标
- 生成汇总统计报告
- 可视化细胞分布热力图
7.5 定义屏蔽图层（Image Plug）
- 定义不需要分析的区域（如气泡、杂质）
- 手动绘制屏蔽区域
- 自动排除屏蔽区域内的细胞
- 提高分析准确性
八、高级分析 🧬
8.1 使用 Image Prime 进行高内涵分析
Image Prime 是 Gen5 的高级分析模块，支持：
- 多参数同时分析
- 复杂细胞表型分类
- 高通量筛选（HTS）数据管理
- 统计分析和可视化
8.2 次级 Mask（Secondary Mask）
次级 Mask 用于在已识别的细胞内进一步分割结构：
- 细胞核 Mask（使用 DAPI/Hoechst 通道）
- 细胞质 Mask（细胞区域减去细胞核区域）
- 特定细胞器 Mask（线粒体、溶酶体等）
注意：如果使用 2-4 通道作为主 Mask，结果显示为"检测值"；作为次级 Mask，则显示为"检测值_2"。
8.3 创建散点图或直方图
- 选择 X 轴和 Y 轴指标
- 设置门限定义亚群
- 使用图表定义亚群边界
- 导出图表和统计数据
8.4 点计数（Spot Counting）
用于计数离散的目标（如荧光点、集落、菌落）：
- 设置点检测参数（最小/最大尺寸）
- 设置强度阈值
- 自动计数并标记
- 导出计数结果
8.5 创建自定义对象指标
- 组合已有指标创建新指标
- 例如：核质比 = 核面积 / 细胞质面积
- 荧光强度比率 = 通道1强度 / 通道2强度
- 自定义指标可用于亚群分类和统计分析
九、板布局、报告导出、数据存储 📁
9.1 板布局（Plate Layout）
- 定义实验孔的分组和重复
- 设置对照组和处理组
- 标注样品名称和浓度
- 可视化板布局图
9.2 报告和报告导出
- 生成标准报告（PDF、Excel）
- 自定义报告模板
- 包含图像、数据表、统计图表
- 支持批量导出
9.3 图像保存
- 图像保存为 16-bit 灰阶 TIFF 文件
- 支持本地存储
- 支持安全网络存储
- 可设置自动备份
十、硬件与设置 ⚙️
10.1 LED-滤光片模块和物镜
- 多种 LED 激发光源（4-7 色可选）
- 标准滤光片 Cube：DAPI、FITC、TRITC、Cy5 等
- 物镜配置：4×、10×、20×、40×（空气）、60×（油镜）
- 自动滤光片切换和物镜切换
10.2 成像系统光路
BioTek 成像系统采用倒置显微镜光路设计：
- LED 光源 → 激发滤光片 → 二向色镜 → 物镜 → 样品
- 发射光 → 发射滤光片 → 相机
- 支持明场、相差、荧光等多种成像模式
10.3 仪器和配件
- Cytation 系列：成像 + 酶标仪一体化系统
- Lionheart FX：自动化活细胞成像系统
- BioSpa 8：自动化细胞处理系统
- 双试剂注射器：在线加药
- 气体控制模块：CO₂/O₂ 环境控制
- 微孔板和耗材：支持多种标准和非标准容器
10.4 耗材
- 标准 96 孔、384 孔透明底微孔板
- 特殊底材质（玻璃底、聚合物底）
- 适配器和转换板
- 浸油（油镜专用）
联系人｜李东伟
📞 18045130660
🌐 主页：https://www.biokingdom.top