血管化 + 免疫活性脑类器官模拟胶质母细胞瘤微环境与放疗响应
Raguin J et al. | Cell Reports Methods 2026;6:101425 | DOI: 10.1016/j.crmeth.2026.101425
标签: #iPSC #类器官 #脑 #胶质母细胞瘤 #血管化 #小胶质细胞 #BBB #放疗 #GBM微环境
一、做什么 🔬
研究背景
胶质母细胞瘤（GBM）是成人最致命的原发性脑肿瘤，5 年生存率 < 5%，标准治疗为手术 + 放疗（60 Gy/30 分次）+ 替莫唑胺化疗。但 GBM 体外模型长期缺失：
- 传统 2D 细胞培养丢失三维结构与微环境
- 裸鼠皮下移植瘤缺失脑组织特异性的神经元-胶质-血管-免疫相互作用
- 既有人源脑类器官（cerebral organoids）普遍缺乏功能性血管与免疫组分（microglia），无法模拟 GBM 与微环境的"对话"
核心问题
能否用 iPSC 衍生同时具有血管网络 + 功能性 microglia 的脑类器官（Complex Cerebral Organoids, CCOs），模拟 GBM 干细胞（GSCs）侵袭与放疗响应？
研究模型
| 类器官 | 简称 | 关键组分 | 来源 |
|---|---|---|---|
| 常规脑类器官 | COs | 神经元 + 星形胶质 + 祖细胞 | iPSC |
| 复合脑类器官 | CCOs | COs + HECs（血管内皮祖细胞）→ CD31+ 血管 + P2RY12+ microglia + BBB | iPSC |
iPSC 系：PDF01（健康供体）+ GM25256（Coriell GM12878 来源 iPSC 系）双系验证
技术路线
- iPSC → HECs（hematoendothelial progenitors）分化：基于已发表方法（参考文献 25），获得 CD31+ 早期内皮/造血祖细胞
- iPSC → 神经诱导 → embryoid bodies：DMEM/F12 + N2 + B27，嵌入 GFR Matrigel 形成 cerebral organoids（25）
- CCOs 构建：将同一 iPSC 系来源的 COs 与 HECs 共培养 → 形成血管化 + 免疫活性脑类器官
- 关键表征：
- 血管：CD31+ 内皮 + Collagen IV 基底膜 + ZO-1 紧密连接（BBB 标志）+ PDGFRβ+ pericytes
- microglia：Iba1+ + P2RY12+ + CD11b+ + CX3CR1+（人类 microglia 核心标志）
- 神经元：βIII-tubulin+ + PSD95 突触后致密区
- 体内验证：CCOs 皮下异种移植到 nude 小鼠 → 心室内灌注 FITC-dextran → 验证血管可灌注 + 与宿主血管 anastomosis
- GBM 模型：TG16（GBM-derived GSCs）+ TG20（astrocytoma-derived GSCs）共培养 → 模拟 GBM 微环境
- 放疗响应：CCO-GSC 共培养 → 2 Gy 照射（模拟临床分次放疗）→ bioluminescence 追踪 GSC 增殖 + RT-qPCR 测 NES 基因（SPP1/POSTN/FOSL2/ANXA1/CXCL12）
关键创新
CCOs 首次同时整合：①功能性血管网络（具 BBB 特征）②microglia（具突触吞噬功能）③iPSC 双系验证可重复。"Complex" 强调相比传统 COs，CCOs 在免疫-血管-肿瘤三维互作上的多组分优势。
二、发现什么 📊
核心发现 1：CCOs 内 CD31+ 血管样结构 + ZO-1 紧密连接（BBB）
Figure 1：CCOs 中血管样结构的形态与 BBB 特征。500 μm 切片 CD31 免疫荧光（A）+ 5 μm 薄切片 CD31/Collagen IV 共染（B-C）+ CD31/S100β/ZO-1 三重染色显示血管-星形胶质-BBB 紧密连接（D-D′′）。iPSC 系：PDF01 + GM25256。
| 维度 | 内容 |
|---|---|
| 做了什么 | DIV71（71 days in vitro）CCOs 切片 → CD31 免疫荧光（500 μm 厚片 + 5 μm 薄片）+ 3D 重建 + Collagen IV 共定位 + ZO-1 紧密连接染色 |
| 发现什么 | CCOs 内形成广泛的 CD31+ 血管样网络；CD31+ 结构周围有 Collagen IV 基底膜包裹；CD31+ 内皮与 S100β+ 星形胶质紧密接触，表达 ZO-1 紧密连接蛋白（具备 BBB 结构特征）；在 PDF01 与 GM25256 两系中均观察到 |
| 说明什么 | CCOs 的血管不仅"有"，而且具备功能性 BBB 的形态学基础——这是脑类器官模拟 GBM 血脑屏障穿透与药物递送研究的前提条件 |
核心发现 2：异种移植后 CCOs 血管可灌注 + 与宿主血管 anastomosis
Figure 2：CCOs 皮下异种移植 1 月后血管可灌注。FITC-dextran 心室内灌注标记功能性血管（A）+ 人特异性 CD31 vs 鼠血管区分（B）+ 3D 重建显示血管腔与 FITC-dextran 灌注（C）+ 人-鼠血管 anastomosis（D-D′）+ PDGFRβ+ pericytes 覆盖（E-E′′）。iPSC：GM25256。n=6 只小鼠，2 次独立实验。
| 维度 | 内容 |
|---|---|
| 做了什么 | CCOs 皮下移植到 nude 小鼠后肢 → 1 月后心室内灌注 FITC-dextran → 切片分析 FITC+ 血管与人特异性 CD31+ 共定位 |
| 发现什么 | CCOs 内形成 FITC-dextran 可灌注的血管腔（功能性血管）；人源 CD31+ 血管与周围鼠血管形成 anastomosis（双色箭头指示）；CD31+ 血管覆盖 PDGFRβ+ pericytes（成熟血管标志） |
| 说明什么 | CCOs 血管不仅形态完整，还能与宿主循环系统连通——这是脑类器官"血管化"的金标准验证，解决了"前人 vascular organoids 缺乏 lumen 导致无血流时细胞凋亡"的痛点 |
核心发现 3：CCOs 中 microglia 样细胞发育成熟 + 突触吞噬功能
Figure 3：CCOs 中 microglia 样细胞发育与功能。500 μm 切片 CD31 + Iba1 染色（A-A′）+ Iba1 与 P2RY12 共定位（B-B′′）+ Iba1+ 细胞内吞 PSD95（C-C′′）。iPSC：PDF01 (A-B) + GM25256 (C)。
| 维度 | 内容 |
|---|---|
| 做了什么 | CCOs 切片 → Iba1（小胶质通用 marker）+ P2RY12（人类 microglia 特异 marker）共定位；PSD95（突触后致密蛋白）与 Iba1 共定位分析 microglia 突触吞噬功能 |
| 发现什么 | CCOs 内 Iba1+ 细胞几乎全部共表达 P2RY12（人类 microglia 表型）；Iba1+ 细胞内吞神经元 PSD95（microglia 突触修剪功能）；CD31+ 血管周围富集 Iba1+ microglia（符合脑生理） |
| 说明什么 | CCOs 的 microglia 不仅是数量存在，更具备功能成熟度——能执行"突触吞噬"这一 microglia 在脑发育与神经退行性疾病中的关键功能 |
核心发现 4：microglia 形态随培养时间成熟 + 长期培养可维持
Figure 4：Iba1+ microglia 形态随培养时间延长而成熟。DIV56（A-A′′）vs DIV126（B-B′′）的 Iba1 染色对比。iPSC：GM25256。
| 维度 | 内容 |
|---|---|
| 做了什么 | 对比 DIV56（56 天）与 DIV126（126 天）CCOs 的 Iba1+ microglia 形态学（分支复杂度、胞体大小、突起长度） |
| 发现什么 | Iba1+ 细胞突起从 DIV56 的简单形态演化为 DIV126 的复杂分支形态（成熟 microglia 标志，类阿米巴样 → 分支状）；microglia 长期存活至 DIV126（>4 个月长期培养） |
| 说明什么 | CCOs 支持 microglia 体内样成熟过程——这要求类器官提供长期培养能力，与 CelVivo ClinoStar 旋转培养技术天然契合 |
核心发现 5：FACS 定量证实 CCOs 关键细胞群稳定 + 细胞因子依赖
Figure 5：CCOs 关键细胞群 FACS 定量。CD31+ 内皮细胞随时间变化（A-A′）；CD45+CD11b+P2RY12+ microglia 群随时间变化（B-B′′′）；GM-CSF/IL-34/VEGF 添加 vs 撤除对 microglia 维持的影响（C-C′）。iPSC：PDF01 + GM25256 双系验证。
| 维度 | 内容 |
|---|---|
| 做了什么 | FACS 定量 CD31+ 内皮、CD45+CD11b+P2RY12+ microglia 在不同 DIV 的比例；测试撤除外源 GM-CSF/IL-34/VEGF 对 microglia 维持的影响 |
| 发现什么 | 内皮细胞与 microglia 在 CCOs 内长期稳定维持；microglia 数量在添加 GM-CSF/IL-34/VEGF 时保持稳定，撤除外源因子后 microglia 数量下降（证实 microglia 维持对外源因子的依赖）；两 iPSC 系间无显著差异 |
| 说明什么 | 提供了 CCOs 质量控制定量标准——未来产业化应用中，可通过 FACS 表征 CCO 批次稳定性 |
核心发现 6：CCO-GSC 共培养模拟 GBM 肿瘤微环境
Figure 6：GSCs 与 CCOs 共培养模拟 GBM 微环境。TG16-GSCs (A) + TG20-GSCs (B) EGFP 标记共培养 4 周；FACS 定量 GSC 增殖（C）；GSC 与 Iba1+ microglia 接触（D-E）+ 与 CD31+ 血管接触（F-G，TG20 显示 co-opt 现有血管）。iPSC：PDF01 (A, B, D-G) + GM25256 (C)。数据为中位数+四分位距。
| 维度 | 内容 |
|---|---|
| 做了什么 | TG16（GBM-derived）+ TG20（astrocytoma-derived）GSCs 与 CCOs 共培养 4 周 → EGFP 标记追踪 + FACS 定量 + 空间定位分析（microglia 接触 / 血管接触） |
| 发现什么 | 两 GSC 系均能在 CCOs 内存活并增殖；GSCs 优先定位在 Iba1+ microglia 附近（免疫微环境招募）；TG20 显示 vascular co-option（GSCs 利用现有血管）；TG16 比 TG20 侵袭性更强 |
| 说明什么 | CCOs 重建了 GBM 的核心微环境特征：①GSC 增殖与侵袭 ②microglia 招募 ③血管共选择——这是全球少数几个具备完整免疫-血管-肿瘤三维互作的 GBM 模型 |
核心发现 7：CCO niche 加重 TG16 放疗后侵袭性
Figure 7：CCO niche 加重 TG16 GBM 放疗后侵袭性。TG16-CCO 共培养 14 天 → 照射 (IRR) vs 不照射 (NIR) → bioluminescence 测 GSC 增殖（D16/D23，A-B）+ FACS 分选 EGFP-GSC 测 NES 基因（SPP1/POSTN/FOSL2/ANXA1/CXCL12, C）。iPSC：PDF01 + GM25256 双系。统计：Kruskal-Wallis + Dunn post hoc。
| 维度 | 内容 |
|---|---|
| 做了什么 | TG16-GSC 与 CCOs 共培养 14 天 → 2 Gy 照射（模拟临床分次放疗）→ bioluminescence 测 D16/D23 GSC 增殖 → FACS 分选 EGFP-GSC 测 NES（natural evolution signature）基因 |
| 发现什么 | 照射后 TG16 在 CCO 共培养中增殖显著增强（与常规 CO 比）；NES 基因中 SPP1、POSTN、FOSL2、ANXA1、CXCL12 协同上调——这与 GBM 临床"边缘侵袭逃逸放疗"现象一致；microglia 表达 HLA-DR/CD11b/CD163/CD206 增加（向免疫抑制 TAM 表型极化） |
| 说明什么 | 首次证明复杂类器官微环境促进 GBM 放疗后侵袭性——为 GBM 放疗增敏策略（如联合 CSF1R 抑制剂阻断 microglia 极化）提供了机制性证据与可量化的体外平台 |
三、说明什么 💡
科学意义
- 方法学突破：CCOs 首次同时整合血管 + microglia + iPSC 双系验证 → 解决了"脑类器官缺乏免疫-血管组分"的核心痛点
- GBM 模型金标准：相对传统 2D / 裸鼠皮下移植 / 单纯 COs，CCOs 提供了唯一能同时模拟"GBM + BBB + microglia + 血管 + 放疗响应"的体外三维平台
- 放疗增敏机制：CCO 微环境加重 TG16 放疗后侵袭 → 揭示 GBM 临床复发机制 → 指导联合治疗策略
- 转化医学价值：可为抗 GBM 药物（特别是 BBB 穿透药物 + 免疫调节剂）提供高通量筛选平台
局限性
- iPSC 系数量有限：仅 PDF01 + GM25256 双系验证，未覆盖疾病特异性 iPSC（如 GBM 家族遗传综合征 iPSC）
- GSC 异质性：仅用 TG16 + TG20 两个系，GBM 患者间异质性大
- 缺乏免疫细胞动态追踪：microglia 表型仅终点分析，未做活细胞成像
- 临床相关性待验证：CCO niche 加重放疗侵袭的机制是否在临床 GBM 中存在需进一步验证
四、与我们的产品 🧬
| 产品线 | 关联度 | 切入点 |
|---|---|---|
| CelVivo ClinoStar | ⭐⭐⭐⭐⭐ | iPSC 双系 → 多组分 CCOs（血管 + microglia + 神经元）→ >4 个月长期培养（DIV126 microglia 成熟）= ClinoStar 旋转培养主战场。CCO 构建涉及 HECs + 神经诱导 + 长期维持三个阶段，每阶段 ClinoStar 均可替代静态培养 |
| 3Brain BioCAM X / HD-MEA | ⭐⭐⭐⭐⭐ | CCOs 中 microglia 突触吞噬功能（Fig 3C）+ 神经元网络电生理监测是 3Brain HD-MEA 金标准应用。可监测 CCO + GSC 干扰下神经元网络振荡变化（burst rate、synchrony、spike rate） |
CelVivo ClinoStar 应用核心价值
本研究展示的"iPSC 多组分共培养 + 长期功能维持"模式，正是 CelVivo ClinoStar 在国内 CDMO 推广的核心场景——
- 静态培养局限：传统 COs 静态培养 >2 个月会出现"中心坏死"（缺乏血管），microglia 也无法长期维持
- ClinoStar 旋转培养优势：通过低剪切力旋转（0.01-0.1 Pa），模拟微重力环境，支持 >4 个月长期培养无中心坏死
- 多腔并行：CCOs 构建涉及 HECs + 神经诱导 + microglia 维持三阶段，每阶段可在 ClinoStar 不同腔室并行处理 → 大幅缩短实验周期
- CDMO 价值：单一 iPSC 系可衍生血管 + microglia + 神经元 + GSC 测试多种类器官 = 高通量药物筛选管线
iPSC 工业化场景全栈方案
- CDMO 客户：CCOs + ClinoStar 用于 GBM 抗血管生成药物 + 免疫治疗药物筛选
- Biopharma 客户：CCOs + 3Brain HD-MEA 用于脑靶向药物 BBB 穿透与神经元毒性评估
- CRO 客户：CCOs 提供 GBM 放疗增敏机制研究服务
五、参考文献 📚
- Raguin J, Legrand N, Kortulewski T, et al. Human cerebral organoids with microglia and vasculature model glioma stem cell interactions and radiotherapy response. Cell Reports Methods. 2026;6:101425. doi:10.1016/j.crmeth.2026.101425. PMID: 42092360.
- Lancaster MA, Knoblich JA. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 2014;9(10):2329-2340.
- Qian X, et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 2016;165(5):1238-1254.
- Cakir B, et al. Engineering of human brain organoids with blood vessel-like architecture. Nat Methods. 2019;16(11):1169-1175.
- Ormel PR, et al. Microglia innately develop within cerebral organoids. Nat Commun. 2018;9(1):4167.
六、原文下载 📄
📄 Raguin_J_et_al_CellRepMethods_2026_vascularized_cerebral_organoids_glioma.pdf
转发语：iPSC 双系（PDF01 + GM25256）衍生的复合脑类器官（CCOs）首次同时整合功能性血管网络（CD31+ + ZO-1 BBB + PDGFRβ+ pericytes）与功能性 microglia（Iba1+ + P2RY12+ + 突触吞噬），异种移植后血管可灌注并与宿主循环 anastomosis。CCO 与 GBM 干细胞（TG16/TG20）共培养重建肿瘤微环境，2 Gy 放疗后通过 NES 基因（SPP1/POSTN/FOSL2/ANXA1/CXCL12）协同上调加重 TG16 侵袭性——为 GBM 放疗增敏策略提供了唯一能同时模拟 BBB + microglia + 血管 + 肿瘤互作的可量化 iPSC 工业化平台。
联系人：李东伟
📞 18045130660 🌐 https://www.biokingdom.top