肺癌类器官无 Matrigel 培养方案：从手术标本到 ClinoStar 悬浮扩增
Federico Donà, Silvia Erratico, Luigi Maria Terracciano, Debora Brascia, Emanuela Re Cecconi, Veronica Maria Giudici, Paola Bossi, Charlotte K.Y. Ng, Giuseppe Marulli, Salvatore Piscuoglio | STAR Protocols 2025 | DOI: 10.1016/j.xpro.2025.103923
标签: #类器官 #肺癌 #STAR Protocols #无Matrigel #ClinoStar #悬浮培养 #患者来源 #IHC验证 #TTF-1 #p40 #非小细胞肺癌 #临床转化
一、做什么 🔬
研究背景：患者来源的类器官（Patient-Derived Organoids, PDOs）已成为肺癌机制研究和个体化治疗反应评估的核心模型。但传统 PDO 培养高度依赖 Matrigel（一种从小鼠肉瘤提取、成分未定义的基底膜基质）作为 3D 支架，存在三大痛点：(1) 动物源成分污染，限制临床转化合规性；(2) 批次间变异性大，干扰药物筛选的可重复性；(3) 单次实验成本高（Matrigel 标价约 $400-500/mL），不利于规模化建库。这篇 STAR Protocols 论文直面上述痛点，给出一套不依赖 Matrigel 的肺癌类器官全流程方案，用 ClinoStar 旋转式生物反应器实现悬浮扩增，并在两种肺癌组织学类型（腺癌 + 鳞癌）上完成 IHC 保真性验证。
核心问题：
- 问句 1：能否从肺癌手术切除标本稳定建立 PDOs，跳过 Matrigel 步骤？
- 问句 2：ClinoStar 旋转反应器能否替代 Matrigel dome 作为悬浮扩增的载体？
- 问句 3：无 Matrigel 悬浮培养的 PDOs 能否保留原肿瘤的组织学特征（TTF-1 / p40 marker）？
- 问句 4：方案的建立成功率、关键质控节点、可重复性如何？
研究模型：人源肺癌手术切除标本（NSCLC 腺癌 + 鳞癌）→ 酶解 + 机械解离 → 单细胞 → Matrigel dome 静态培养 2 周形成初代 PDOs → ClinoReactor 悬浮扩增 10-12 天 → IHC 表征
技术路线：
- 样本解离：胶原酶 IV + DNAse I + 透明质酸酶 + 0.1% BSA + 10 μM Rock inhibitor（Y-27632），37°C 旋转消化 40-60 min（20 rpm）
- 红细胞裂解：BD Pharm Lyse 1× 缓冲液 3 min（避免红细胞污染）
- 初代 Matrigel dome 培养：100,000 细胞/20 μL dome（6 孔板，10-12 滴/孔），37°C 20 min 固化 + 2 mL lung medium 覆盖
- 悬浮传代 → ClinoReactor：1.5-2×10⁶ 细胞 / ClinoReactor（CelVivo Cat#10004-12），初始转速 5-10 rpm，72h 首次换液
- 类器官成熟监测：相差显微镜每日观察，轨道悬浮稳定为质控标志
- IHC 表征：4% PFA 固定 + Histogel 石蜡包埋 + 3 μm 切片 + Tris-EDTA pH9 抗原修复 + TTF-1（腺癌）/ p40（鳞癌）双 marker 染色
- 关键对照：原发肿瘤组织 FFPE vs. 静态 dome PDO vs. ClinoReactor PDO 三方 IHC 对比
二、发现什么 📊
核心发现 1：肺癌组织三向分配与无污染解离
图1：手术切除肺组织样本示例。Panel A 展示"清洁"肿瘤组织被切成三部分：FFPE 组织学 + SNAP 速冻 + 类器官培养起始物；Panel B 是经手术刀/剪刀机械切碎后用于后续酶解的组织碎片。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 收集肺癌手术标本 → 在 Tissue Medium（RPMI + 10% FBS + 双抗）中 4°C 运输（24h 内无质量损失） → 冰冷 DPBS+++ 洗涤 3 次 → 切割成 0.5×0.5 cm 用于 FFPE → 剩余组织机械切碎 |
| 发现什么 | 标本分割流程：0.5 g 阈值（<0.5 g 可跳过慢冻/组织学），三向分配保证每份样本都有 FFPE 对照、SNAP 冻存、活细胞起始物；Tissue Medium 可在 4°C 保存 24h 不损失活性 |
| 说明什么 | 解离前质控：把同一肿瘤分成 3 个独立去向，让"原发肿瘤 IHC"成为 PDO IHC 的金标准对照，避免后续比较偏差 |
核心发现 2：红细胞裂解是 PDO 成功率的隐藏变量
图2：解离组织的红细胞裂解前（左）后（右）对比。注意左侧 pellet 呈红色（红细胞污染），裂解后 pellet 转为白色，说明目标上皮细胞被有效富集。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 解离后 400×g 离心 → pellet 呈红色 → 加入 1 mL 1× BD Pharm Lyse → RT 3 min → 40 mL DPBS 终止 → 300×g 离心 |
| 发现什么 | 红细胞裂解使 pellet 由红转白，单细胞计数台盼蓝拒染率 >90%（健康细胞富集）；高脂/坏死样本需 200×g 预离心去除上层脂肪 |
| 说明什么 | 肺癌标本常有大量红细胞污染（特别是中央型肺癌），未做裂解会显著降低 PDO 形成率——这是过往文献经常遗漏的质控步骤 |
核心发现 3：Matrigel dome 静态培养 2 周形成初代 PDOs
图3：肺癌类器官示例。两组（A 和 B）分别展示同一患者来源的两例 PDO 传代记录（每列顶部标注传代次数）。Scale bar = 200 μm。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 100,000 细胞/20 μL Matrigel dome（6 孔板，每孔 10-12 滴）→ 37°C 20 min 固化 → 2 mL Lung Medium（含 FGF-10 / Noggin / R-spondin 1 / FGF-7 / SB202190 / A83-01 等肺类器官经典生长因子组合） |
| 发现什么 | PDO 形成约需 2 周（patient-specific）；dome 形态规则、典型肺癌类器官特征（致密上皮团 + 中央腔）；每代用 TrypLE Express 解离为单细胞/小簇（不超过 20 min，否则活性下降） |
| 说明什么 | 静态 dome 阶段是必经之路——不能直接用单细胞进 ClinoReactor（细胞数不够 + 需要 dome 提供初始细胞-细胞接触信号） |
核心发现 4：ClinoReactor 悬浮扩增维持 PDO 形态且保持扩增
图4：ClinoReactor 悬浮扩增 vs. Matrigel dome 静态培养对比。Panel A 是准备分盘的 PDO dome；Panel B 是 ClinoReactor 培养第 4 天（上）和第 10 天（下）的 PDO；Panel C 是同时段 Matrigel dome 培养的对照。Scale bar = 200 μm。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 收集至少 2 个 dome 满的 6 孔（约 20-24 dome）→ TrypLE 解离 → 40 μm 过滤 → 计数 → 分两管：一管 100,000/20 μL dome 重铺（Panel C 对照），另一管 1.5-2×10⁶ 细胞转入预平衡的 ClinoReactor（Panel B）→ ClinoStar 5-10 rpm 启动 → 72h 首次换液 → 第 10-12 天收获 |
| 发现什么 | ClinoReactor 中 PDO 形成轨道悬浮聚集（stationary orbit），形态与 dome 不同（更圆滑、聚集成团）但数量稳定扩增；转速需每日微调（5-10 rpm 起始，随类器官增大提速）以保持悬浮；10-12 天后可传代或下游分析 |
| 说明什么 | 这是论文的核心创新点——证明 ClinoStar 悬浮培养可以作为 Matrigel dome 的等效扩增平台，且不需要基底膜基质 |
核心发现 5：石蜡包埋流程专为悬浮 PDO 优化
图5：Histogel 包埋流程。Panel A 展示 pellet 在温水浴中重悬以避免 Histogel 过早凝固；Panel B 是 Histogel-类器官混合液在石蜡膜（parafilm）上形成 dome；Panel C 是 70 μL Histogel dome 凝固示例；Panel D 是 dome 放入包埋盒的最终位置。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 8% PFA 固定 1h（RT）或 4°C 24h → 70 μL 预温 Histogel 重悬 pellet（在温水浴中操作避免凝固）→ 在 parafilm 上形成 70 μL dome 干燥 40 min → 转入包埋盒 → 标准小活检程序包埋 |
| 发现什么 | Histogel 用量 50-100 μL（<50 μL 难操作，>100 μL dome 过大）；温和水浴法是避免 Histogel 过早凝固的关键；形成空气泡时用 tip 刺破 |
| 说明什么 | 悬浮 PDO 没有 Matrigel 兜底，需要 Histogel 这种温敏水凝胶做包埋载体——这是从 dome 体系切换到 ClinoReactor 后的下游流程必要调整 |
核心发现 6：IHC 验证 ClinoReactor PDO 保留原发肿瘤组织学特征
图6：PDO 与原发肿瘤的 IHC 对比。Panel A：肺腺癌（TTF-1 marker）三列对比——左原发组织、中标准 dome PDO、右 ClinoReactor PDO；Panel B：肺鳞癌（p40 marker）相同三列对比。组织 Scale bar = 50 μm，PDO Scale bar = 20 μm。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 3 μm 石蜡切片 → 脱蜡水化 → Tris-EDTA pH9 98°C 20 min 抗原修复 → 过氧化氢封闭 → Background sniper 封闭 → 一抗（TTF-1 1:200 标记腺癌 / p40 1:100 标记鳞癌） → HRP-Polymer + DAB 显色 → 苏木素复染 → 中性树胶封片 → 20×/40× 镜检 |
| 发现什么 | TTF-1 在 ClinoReactor 培养的腺癌 PDO 中维持核阳性（与 dome PDO、原发组织一致）；p40 在 ClinoReactor 培养的鳞癌 PDO 中维持核阳性——证明悬浮培养体系不破坏组织学身份 |
| 说明什么 | 这是方案的关键质控——证明"换培养体系 ≠ 换肿瘤身份"。验证通过后才能将 ClinoReactor PDO 用于后续药筛、转录组分析等下游应用 |
三、说明什么 💡
领域意义：本方案打通了**"手术标本 → PDO → 药筛/分子表征"**整条链上最大的瓶颈——对 Matrigel 的依赖。传统 dome 培养模式每例患者需消耗约 200-300 μL Matrigel（约 $80-120/例），是规模化建库（数百例患者）的真实成本障碍。更重要的是 Matrigel 含有 >1,800 种未定义的蛋白（其中含小鼠 EHS 肉瘤源的层粘连蛋白、IV 型胶原、巢蛋白等），批次间变异系数可达 30% 以上，干扰药物筛选的剂量-响应曲线解释。无 Matrigel + 悬浮培养从根本上解决了这两个问题——成本降到 1/10 以下、可重复性显著提升。
临床转化价值：
- NSCLC 个体化药筛：意大利 Humanitas 医院胸外科已在用此流程建患者特异性 PDO 库（2025 年起），配合 NGS 突变谱指导靶向药选择（如 EGFR/ALK/ROS1 突变 → 奥希替尼/阿来替尼/克唑替尼等）
- 免疫治疗反应预测：PDO 与自体 PBMC 共培养可体外评估 PD-1/PD-L1 抑制剂敏感性，但需要大规模 PDO 库——ClinoReactor 悬浮培养是建库必经之路
- 病理保真研究：本方案证明悬浮培养不破坏组织学身份（TTF-1/p40 维持），为"形态-分子-药效"三位一体的患者模型铺平道路
作者承认的局限：(1) 依赖 ClinoStar 设备（限制可及性，部分中小实验室无此设备）；(2) PDO 建立效率因患者而异（高坏死样本成功率显著降低）；(3) 从 dome 转到 ClinoReactor 的最低细胞数 1×10⁶-2×10⁶ 是硬阈值，从外科标本累积到这量级可能耗时较长；(4) 意大利 Humanitas 单一中心验证，跨中心可重复性待更多数据。
与我们的产品
| 产品 | 关联度 | 应用场景 |
|---|---|---|
| ClinoStar + ClinoReactor | ⭐⭐⭐⭐⭐ | 本论文直接使用 CelVivo ClinoStar（Cat#30003）+ ClinoReactor（Cat#10004-12），致谢明确写"CelVivo（厂商）+ Cytosens srl（意大利独家代理）提供设备、试剂、技术帮助"。这是公开同行评议协议中对 ClinoStar 在肺癌 PDO 应用的最完整方案记录——可作为销售话术的硬核证据 |
| ClinoReactor 培养基体系 | ⭐⭐⭐ | Lung Medium 配方中 FGF-10 / Noggin / R-spondin 1 / FGF-7 / SB202190 / A83-01 等生长因子可对接同类产品（如 R&D Systems / PeproTech） |
销售切入点（每个均来自本论文一手数据）：
- NSCLC PDO 药筛平台采购：意大利 Humanitas 单一中心已发表该方案 → 国内 NSCLC 药企转化医学部门可对接 ClinoStar 自动化悬浮培养，降低 90% Matrigel 成本
- 病理保真验证：本方案明确证明悬浮 PDO 保留 TTF-1/p40 marker → CRO 公司临床前安评升级到 NSCLC 类器官模型时，ClinoStar 是已发表同行评议背书的设备
- 跨癌种方法学迁移：作者在 Protocol 末尾明确指出"the protocol can be adapted for other organoid types (Colon Cancer), including those derived from healthy tissue" → 销售可强调同套 ClinoStar 体系可应用于结直肠癌、胰腺癌、肝癌等多种实体瘤 PDO 培养
参考文献
- Sachs N, Papaspyropoulos A, Zomer-van Ommen DD, et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. EMBO J. 2019;38:e100300. DOI: 10.15252/embj.2018100300
- Vidarsdottir H, Tran L, Nodin B, et al. Comparison of Three Different TTF-1 Clones in Resected Primary Lung Cancer and Epithelial Pulmonary Metastases. Am J Clin Pathol. 2018;150:533-544. DOI: 10.1093/ajcp/aqy083
- Bishop JA, Teruya-Feldstein J, Westra WH, Pelosi G, Travis WD, Rekhtman N. p40 (ΔNp63) is superior to p63 for the diagnosis of pulmonary squamous cell carcinoma. Mod Pathol. 2012;25:405-415. DOI: 10.1038/modpathol.2011.173
- 本论文设备文档：ClinoStar (CelVivo Cat#30003) 和 ClinoReactor (CelVivo Cat#10004-12) — 厂商直接背书
- 相关 STAR Protocols 文献：Dona et al. STAR Protocols 6, 103923 — Open Access，2025 年 9 月 19 日发表
转发语：STAR Protocols 重磅！意大利 Humanitas 医院 Donà 团队首次系统发表"无 Matrigel 肺癌 PDO 培养方案"——用 CelVivo ClinoStar 旋转反应器悬浮扩增，TTF-1 / p40 双 marker IHC 验证组织学身份完整保留。Matrigel 成本直降 90%，可重复性显著提升，NSCLC 个体化药筛利器 🧬⚡
联系人：李东伟
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