DMSO 预处理 hiPSC 提升肾元祖细胞和肾脏类器官分化效率
Kearney H, Rak-Raszewska A, Seijas-Gamardo A et al. | Stem Cell Reviews and Reports 2025;21:2745–2764 | DOI: 10.1007/s12015-025-10971-z
标签: #iPSC #肾脏类器官 #DMSO #分化优化 #肾元祖细胞 #Morizane protocol #Maastricht #CelVivo应用场景
一、做什么 🔬
研究背景
人诱导多能干细胞（hiPSC）自 Yamanaka 2006 年发现以来，已发展为类器官分化的核心来源。但 hiPSC 处于"primed state"（primed 多能态），与胚胎干细胞的"naive state"差异显著，分化效率受限。肾脏类器官（kidney organoids）虽然已有 Morizane 2017 等成熟 protocol，但肾元祖细胞（nephron progenitor cells）的诱导效率仍不稳定——批次间变异大、不同 hiPSC 系效率差异显著。
核心问题
低剂量二甲基亚砜（DMSO, 1-2%）预处理 hiPSC 24 小时，能否改善 hiPSC 集落形态、调整多能态、提升下游肾元祖细胞（SIX2+）和肾类器官（Nephrin+, Megalin+）的分化效率？
研究模型
| 维度 | DMSO 处理组 | 对照组 |
|---|---|---|
| 细胞系 | LUMC-GFP+ hiPSC（Maastricht U） | LUMC-GFP+ hiPSC（无 DMSO） |
| DMSO 浓度 | 0%（对照）、1%、2% | 0% |
| 处理时间 | 24h（hiPSC 培养期） | 不处理 |
| 下游应用 | 肾类器官分化（Morizane 2017 protocol） | 同左 |
| 检测时间点 | D0, D1, D3, D4, D9, D21 | 同左 |
技术路线
- hiPSC 培养期 DMSO 预处理（0/1/2%, 24h）
- 多能性 marker 表达：OCT4, NANOG, SOX2（qPCR + 流式细胞术）
- 表观遗传分析：H3K27me3、H3K9me3 免疫荧光
- 细胞周期分析：PI 染色流式细胞术
- 集落形态定量：荧光显微图像分析（数量、周长、凸性、圆度）
- 下游肾分化：Morizane 2017 协议（CHIR99021 + Noggin → SIX2+ 肾元祖 → Nephrin/Megalin+ 肾类器官）
- 蛋白表达：Nephrin, Megalin, GATA3, SIX2 免疫荧光 + 定量
二、发现什么 📊
核心发现 1：低剂量 DMSO 调整 hiPSC 多能态但不影响核心多能性 marker
Figure 1：LUMC hiPSC 多能性 marker 表达 + 细胞周期分析（DMSO 处理）。
| 维度 | 内容 |
|---|---|
| 做了什么 | DMSO 0/1/2% 处理 hiPSC 24h；qPCR 测多能性 marker（OCT4, NANOG, SOX2）；流式细胞术分析细胞周期（G0/G1/S/G2/M 比例）；LDH 释放评估细胞毒性 |
| 发现什么 | 1% 和 2% DMSO 处理 24h 不改变核心多能性 marker 表达（OCT4/NANOG/SOX2 mRNA 与对照无显著差异）；细胞周期：G0/G1 期比例从 60% 增至 68%（1% DMSO）和 75%（2% DMSO），提示细胞进入更"早期/naive-like"状态；LDH 释放无显著增加（无明显毒性）；Ki67+ 增殖细胞比例下降 18%（2% DMSO） |
| 说明什么 | 1-2% DMSO 24h 处理是"温和的多能态调整"——不破坏多能性但使细胞进入更利于分化的状态——这与 DMSO 在胚胎干细胞 naive 转换中的作用一致 |
核心发现 2：DMSO 改变 hiPSC 集落形态
Figure 2：DMSO 处理对 hiPSC 集落形态的定量分析。
| 维度 | 内容 |
|---|---|
| 做了什么 | DMSO 0/1/2% 处理 hiPSC 0-24h；荧光显微成像（GFP+ 集落）；自动化形态定量分析（数量、周长、凸性、圆度） |
| 发现什么 | 2% DMSO 处理 24h 后：集落平均周长减少 35%（从 280 μm 降至 182 μm）；圆度增加 42%（从 0.62 增至 0.88）；凸性减少 28%；集落平均面积减少 41% |
| 说明什么 | DMSO 处理使 hiPSC 集落从"扁平不规则"转向"紧凑圆形"——这是 naive-like 多能态的典型形态学特征（naive hESC 形成 dome-shaped 集落，primed hESC 形成 flat 集落） |
核心发现 3：DMSO 重组 hiPSC 细胞骨架和黏附分子
Figure 3：DMSO 处理对 hiPSC 集落结构（F-actin + DAPI）和黏附分子的影响。
| 维度 | 内容 |
|---|---|
| 做了什么 | 免疫荧光染色 F-actin（Phalloidin）和 DAPI；qPCR 检测黏附分子（CDH1/E-cadherin、CDH2/N-cadherin、ITGα5、ITGα6）；流式细胞术定量蛋白表达 |
| 发现什么 | 2% DMSO：F-actin 在集落边缘富集减少（细胞-细胞连接松散）；CDH1（E-cadherin）mRNA 上调 2.5 倍（naive 多能态标志）；CDH2（N-cadherin）下调 35%（primed 标志）；ITGα5/ITGα6 显著下调；DAPI 染色显示核形态更圆 |
| 说明什么 | DMSO 通过调控 E-cadherin 表达促进 primed → naive 转换——E-cadherin 上调是 naive 多能态的关键分子标志，与形态学结果一致 |
核心发现 4：DMSO 预处理增强中胚层诱导和 SIX2+ 肾元祖细胞生成
Figure 4：DMSO 预处理 hiPSC → 中胚层诱导基因表达（Morizane protocol D0-D4）。
| 维度 | 内容 |
|---|---|
| 做了什么 | DMSO 预处理 hiPSC → 肾分化（D0-D4 中胚层诱导期）；qPCR 检测中胚层 marker（TBXT, MIXL1, MESP1, PAX2, WT1）；流式细胞术定量 |
| 发现什么 | 2% DMSO 预处理：TBXT (T) 上调 3.8 倍（24h）；MIXL1 上调 4.2 倍；MESP1 上调 2.5 倍；PAX2 上调 2.8 倍；WT1 上调 3.2 倍——关键发现：肾元祖 marker SIX2 在 D9 上调 5.8 倍 |
| 说明什么 | DMSO 预处理通过增强中胚层诱导 → 提升肾元祖细胞分化效率——这是 Morizane 2017 协议的"上游优化"，可在不修改分化协议的情况下提高下游类器官产量 |
核心发现 5：DMSO 预处理提升肾类器官蛋白表达
Figure 5：DMSO 预处理 hiPSC 衍生 metanephric mesenchyme 肾元祖细胞（D9）。
| 维度 | 内容 |
|---|---|
| 做了什么 | 肾类器官分化 D21 终点；免疫荧光检测 Nephrin（足细胞）、Megalin（近端小管）、GATA3（输尿管芽）、SIX2（肾元祖）；自动化荧光定量 |
| 发现什么 | 2% DMSO 预处理：Nephrin+ 足细胞增加 3.5 倍；Megalin+ 近端小管增加 2.8 倍；GATA3+ 输尿管芽增加 4.2 倍；分化效率（管状结构数）从对照 12% 提升至 38%（3.2 倍提升） |
| 说明什么 | DMSO 预处理不仅是分子层面的多能态调整，还显著提升肾类器官终末蛋白表达和结构形成——这是面向工业化肾类器官生产的关键优化步骤 |
核心发现 6：DMSO 预处理显著提升整体分化效率
Figure 6：肾类器官分化效率定量 + 蛋白表达汇总（D21）。
| 维度 | 内容 |
|---|---|
| 做了什么 | 综合评估 DMSO 预处理对全程分化效率的影响：集落存活率 + 中胚层诱导率 + 肾元祖率 + 终末类器官形成率 + 多 hiPSC 系验证 |
| 发现什么 | 2% DMSO：集落存活率 95%（vs 对照 92%）；中胚层诱导率 78%（vs 45%）；SIX2+ 肾元祖率 62%（vs 28%）；D21 类器官形成率 38%（vs 12%）——总效率提升 3.2 倍；3 个独立 hiPSC 系验证效果一致 |
| 说明什么 | DMSO 预处理是低成本、易操作的肾类器官效率优化策略——对多个 hiPSC 系均有效，可作为 CDMO 级类器官生产标准操作的前置步骤 |
三、说明什么 💡
科学意义
| 发现 | 意义 |
|---|---|
| DMSO 上调 CDH1/E-cadherin | 揭示 DMSO 介导 primed → naive 多能态转换的分子机制——CDH1 是 naive 多能态核心标志 |
| DMSO 增强中胚层诱导 | 提升下游所有中胚层来源类器官（肾、心脏、肌肉、骨）的分化效率——不仅是肾脏 |
| DMSO 提升肾类器官 3.2 倍效率 | 解决 Morizane 2017 协议"效率不稳定"的瓶颈——为工业化肾脏 CDMO 提供标准化前置步骤 |
| 多 hiPSC 系一致有效 | DMSO 预处理在不同患者来源 hiPSC 中均有效——为患者特异性肾类器官生产提供普适方案 |
局限性
- 仅在 LUMC-GFP+ hiPSC 1 个细胞系详细验证 + 3 个 hiPSC 系小结验证
- DMSO 浓度仅 0/1/2% 三档，最佳浓度需更细粒度优化
- 仅 24h 处理窗口，长时间处理（48-72h）效果未验证
- 未涵盖其他中胚层类器官（心脏、肌肉）分化效率验证
四、与我们的产品 🧬
| 产品 | 关联度 | 应用场景 |
|---|---|---|
| CelVivo ClinoStar | ⭐⭐⭐⭐⭐ | 肾类器官规模化扩增——本研究 2% DMSO 预处理 + Morizane 协议可生成足量 SIX2+ 肾元祖，但 D9-D21 的肾类器官成熟阶段需要长期 3D 培养。ClinoStar 的低剪切力旋转培养支持肾类器官 >30 天成熟（D21+ 时间点），且批次间一致性能保持 DMSO 优化效果 |
| CelVivo ClinoReactor | ⭐⭐⭐⭐ | 肾类器官 CDMO 批量生产——DMSO 预处理 + Morizane 协议规模化扩增，ClinoReactor 10-50 mL 工作体积可批量生产患者特异性 iPSC 肾类器官用于药物筛选 |
iPSC 工业化应用核心价值
本研究展示的"DMSO 预处理 + Morizane 协议 + ClinoStar 长期培养"模板，是 CelVivo 在国内 iPSC 肾脏 CDMO 场景的核心技术路径：
- DMSO 预处理 24h = 几乎零成本的效率提升（仅 DMSO 试剂 + 24h 培养时间）
- Morizane 协议 + ClinoStar = 稳定的肾类器官管线——避免传统静态培养的"核心缺氧"瓶颈
- 3.2 倍效率提升 = 降低 CDMO 单位类器官成本 ~70%——对国内 iPSC 工业化应用意义重大
五、参考文献 📚
- Kearney H, Rak-Raszewska A, Seijas-Gamardo A, et al. Dimethyl sulfoxide conditions induced pluripotent stem cells for more efficient nephron progenitor and kidney organoid differentiation. Stem Cell Rev Rep. 2025;21:2745–2764. doi:10.1007/s12015-025-10971-z. PMID: 40965814.
- Morizane R, Bonventre JV. Generation of nephron progenitor cells and kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 2017;12(1):195-207. doi:10.1038/nprot.2016.170.
- Takahashi K, Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 2006;126(4):663-676. doi:10.1016/j.cell.2006.07.024.
六、原文下载 📄
📄 [Kearney_H_et_al_StemCellRevRep_2025_DMSO_kidney_organoids.pdf](""" + PDF_URL + """)
转发语：Maastricht 团队发现低剂量 DMSO（1-2%, 24h）预处理 hiPSC 通过 E-cadherin 上调促进 primed → naive 多能态转换，提升中胚层诱导效率 2.5-4.2 倍、肾元祖（SIX2+）分化 5.8 倍、D21 肾类器官形成率从 12% 提升至 38%（3.2 倍），多 hiPSC 系验证一致——为 iPSC 肾类器官工业化生产提供零成本、高效率、易操作的前置优化步骤。
联系人：李东伟
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