类器官芯片 + 低温保存液筛选:HPG vs UW 在多细胞肝-on-chip 模型中的单细胞转录组对比
Single-cell transcriptomic profiling reveals cellular stress responses to hypothermic preservation in liver-on-chip model
Single-cell transcriptomic profiling reveals cellular stress responses to hypothermic preservation in liver-on-chip model
第一作者: Joseph Mugaanyi, Jing Huang, Sheng Ye et al. (Caide Lu 通讯)
期刊: Scientific Reports (Nature Portfolio, IF=4.5, gold OA)
DOI: 10.1038/s41598-026-50200-2 | PMID: 42069926
发表: 2026-04-20 Accepted, 2026 在线发表 (Article in Press)
下载: https://fb.biokingdom.top/api/v4/file/content/L98Wf1/0/42069926_sci_rep_liver_on_chip_hypothermic.pdf?sign=WJl7STD29xhLVdlkOkpb_e_XvkE9w3JwtsOgqT7WES0%3D%3A2106393651 (Cloudreve v4 永久 sign URL, 有效期至 2036-09-30, 4.07 MB, %PDF-1.4)
📣 摘要
肝移植的冷保存是不可避免的物流环节,缺血-再灌注损伤 (IRI) 是早期移植物功能障碍的关键驱动力。本研究用 多细胞人肝-on-chip 模型 (PDOs 类器官 + 肝星状细胞 HSCs + 肝窦内皮细胞 LSECs + 巨噬细胞) 比较 临床标准 UW 液 vs 新型 HPG (超支化聚甘油) 液 的 24 小时静态冷保存效果,继而复温。scRNA-seq 在保存-复温时间轴上解析每个细胞类型的转录轨迹。
关键发现 (3 个):
- PDOs: UW 液保存的类器官炎症/氧化应激转录本 (IFI27 / SAA1 / HMOX1) 和线粒体基因 (MT-ND5) 表达显著高于 HPG 组;HPG 液保留更多稳态上皮标记 (EPCAM / KRT18)
- HSCs + LSECs: UW 组纤维化标记 (COL1A1 / TAGLN) 和内皮激活标记 (PECAM1 / VWF) 也显著升高
- HPG = 候选下一代保存液: 在 4 类细胞中均保留上皮稳态、降低应激/纤维化转录程序
核心技术: 12 孔高通量双腔室 OoC + 4 类共培养 + scRNA-seq Harmony 批次校正 + 配体-受体推断 (CellChat / PAGA)
🔬 研究背景
肝移植每年挽救数千名终末期肝病患者的生命,冷保存 (cold preservation) 是从供体取肝到受体植入之间的必经环节,通常维持 4-24 小时。保存液的选择直接决定移植后早期移植物功能 (early allograft dysfunction, EAD) 的发生率。UW 液 (University of Wisconsin solution) 自 1987 年起作为临床金标准,但持续暴露于 UW 仍可导致 缺血-再灌注损伤 (IRI),伴随炎症风暴、氧化应激、内皮激活与肝星状细胞活化 (肝纤维化启动)。
| 维度 | UW 液 (1987-至今) | HPG 液 (新型) |
|---|---|---|
| 渗透压保护 | 乳糖醛酸 + 棉子糖 | 超支化聚甘油 (hyperbranched polyglycerol) |
| 抗氧化 | 谷胱甘肽 + 别嘌呤醇 | HPG 自带抗氧化基团 |
| 黏度 | 高 (乳糖醛酸增稠) | 中 (HPG 水溶液) |
| 临床证据 | 30+ 年大规模 RCT | 体外 + 啮齿类实验 |
关键空白: 现有保存液对比研究大多用 全组织 bulk RNA-seq,无法解析单个细胞类型的转录响应。本研究是首个用 scRNA-seq 比较 UW vs HPG 在多细胞肝-on-chip 模型中的转录差异,直接揭示哪种细胞在哪种保存液下损伤最严重。
研究目标 (3 个 numbered):
- 揭示冷保存过程中 PDOs / HSCs / LSECs / 巨噬细胞的细胞类型特异性转录响应
- 比较 UW vs HPG 在 4 类细胞中的转录差异图谱
- 验证 HPG 是否能保留上皮稳态 + 抑制应激/纤维化转录程序,作为下一代保存液候选
🧪 实验方法
4.1 器官芯片系统
核心设备: 12 孔高通量双腔室 organ-on-chip (OOC) 系统 (Avatarget Co., Ltd., 苏州) — 国产化 OoC 平台代表,9 月实战关注的国产仪器代理谱系重要候选。
结构:
- 上腔室 (upper chamber): PDOs (Patient-Derived Organoids) + LX-2 (肝星状细胞系) 共培养,包埋于 Matrigel (Corning Cat#356255)
- 下腔室 (basal chamber): Liver Sinusoidal Endothelial Cells (LSECs) + 诱导分化巨噬细胞 (THP-1)
- 多孔 PDMS 膜: 隔开上下腔但允许旁分泌信号 (paracrine) 通过
培养条件: 37°C + 5% CO₂,3 天预培养后用 摇床灌注 (±7° 倾角, 30 min 周期, AvatarFlow Organ Chip Flow Initiation Controller System 同厂设备)。
4.2 生物样本
- PDOs: 来自 9 名不同供体 (7 男 + 2 女),肝组织活检后用 Avatarget 肝类器官扩增培养基培养
- LSECs / LX-2 / THP-1: 均来自 Avatarget 苏州
- 伦理审批: 宁波医疗中心李惠利医院伦理委员会 (KY2025SL367-01),符合 Helsinki 宣言
4.3 保存实验设计 (5 个实验组)
| 实验组 | 简称 | 处理 |
|---|---|---|
| 1. 保存前基线 | Pre | OoC 培养 3 天后立即取样 |
| 2. HPG 冷保存 24h | HPG_24h | 4°C 静态 HPG 液 |
| 3. UW 冷保存 24h | UW_24h | 4°C 静态 UW 液 (临床金标准对照) |
| 4. HPG 后复温 | HPG_rewarm | HPG 24h → 37°C 复温 |
| 5. UW 后复温 | UW_rewarm | UW 24h → 37°C 复温 |
4.4 单细胞测序与分析
- 质控: 每个细胞 ≥ 200 基因 / ≤ 15% 线粒体 reads,共 20,000+ 高质量细胞 进入下游
- 批次校正: Harmony 整合 5 个实验组,UMAP 验证前后差异 (Fig 2A vs 2B)
- 细胞类型注释: 4 类 — PDOs (EPCAM / KRT8 / KRT18) / HSCs (COL1A1 / TAGLN / ACTA2) / LSECs (PECAM1 / VWF / KDR) / 巨噬细胞 (LYZ / S100A8 / IL1B)
- 轨迹分析: DPT (Diffusion Pseudotime) + PAGA (Partition-based Graph Abstraction) 量化细胞状态过渡
- 配体-受体推断: CellChat / NicheNet 类算法解析细胞间通讯
📊 核心结果与配图
发现 1: 单细胞测序解析 4 类细胞 + Harmony 整合 (图 1 + 图 2)
做了什么: OoC 接种后 3 天用 3 标志物免疫荧光鉴定 PDOs (图 1);5 实验组 scRNA-seq 跑 Harmony 整合,UMAP 看批次效应去除 (图 2)。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | PDOs Day 3/6/9 明场相差 + Albumin/KRT8/EPCAM 免疫荧光 + 5 组 scRNA-seq + Harmony + UMAP |
| 发现什么 | 20,000+ 高质量细胞,4 类清晰分群 (图 2A 校正前蓝色基线组明显按批次分离 → 图 2B 校正后充分混合);6 张 UMAP/DotPlot 验证细胞类型注释 |
| 说明什么 | OoC 模型构建成功,可作为研究冷保存细胞响应的稳健平台;Harmony 整合排除了批次效应,让后续跨组比较可信 |
)
图 1 说明 (659 字): 图 1. 接种到肝芯片前的患者来源类器官 (PDOs) 表征。(A) PDOs 在基质胶中扩增培养第 3、6、9 天的明场相差显微图像, 球体直径逐渐增大、膜边界清晰, 表明形态正常、扩增成功。(B) 成熟肝上皮系标志物免疫荧光染色: 白蛋白 (绿色, 成熟肝细胞标志物)、KRT8 (黄色, 上皮/细胞骨架标志物)、EPCAM (绿色, 上皮身份标志物); DAPI (蓝色) 细胞核; 比例尺 = 50 µm。
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图 2 说明 (505 字): 图 2. 跨实验条件的单细胞图谱与 Harmony 整合。(A) Harmony 批次校正前的 UMAP, 按样本条件着色, 样本驱动分离显著。(B) Harmony 校正后, 5 个条件的所有细胞充分混合, 批次效应消除。(C) DPT 伪时间 UMAP (紫色=起点, 黄色=终点)。(D) 按细胞类型着色的 PAGA UMAP: 肝星状细胞/肝细胞/肝窦内皮细胞/巨噬细胞/静息态肝星状细胞。(E) 按条件着色的 PAGA UMAP: 5 个条件均匀分布。(F) 细胞类型标志基因点图, 验证注释准确性。
发现 2: UW 液比 HPG 液触发更多炎症/线粒体应激 (图 3 + 图 4)
做了什么: 比较 5 实验组在每个细胞类型中的差异表达基因 (DEGs),重点看 PDOs 炎症/氧化应激通路 + 线粒体基因。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | PDOs 5 实验组 DEG 分析 + Heatmap 13 个关键基因 + 5 张单基因时序折线图 (Fig 3 Fig 4) |
| 发现什么 | UW 组 IFI27 / SAA1 / HMOX1 (急性相/炎症) + MT-ND5 (线粒体) 显著上调;HPG 组 EPCAM / KRT18 (上皮稳态) 保留更好;UW 复温后 SAA1 远高于 HPG 复温 |
| 说明什么 | HPG 在转录组层面显著优于 UW 液 — 保留上皮稳态,降低冷保存诱导的炎症与线粒体应激 |
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Fig 3 caption (~400 chars): PDO 5 实验组 UMAP + 各实验组 PDO 占比饼图 + 各处理组 PDO 平均数柱状图 — 显示 UW 24h 后 PDO 数量显著下降,HPG 组保持稳定。
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图 4 说明 (550 字): 图 4. PDOs 在保存-复温轴上的聚集表达模式与转录轨迹。(A) 13 个应激/炎症/线粒体标志基因在 5 个条件 (保存前/HPG_24h/UW_24h/HPG_复温/UW_复温) 下的平均对数标准化表达热图。(B) 5 个关键基因 (ANGPT2/IFI27/SAA1/MT-ND5/MT1E) 的时序表达 - 蓝线 HPG/橙线 UW; UW 组下降更陡, HPG 组保留更好。
发现 3: UW 液激活纤维化与内皮激活程序 (图 5)
做了什么: 看 HSCs (纤维化标记) 和 LSECs (内皮激活) 在 5 实验组的时序轨迹。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | HSCs + LSECs 单基因时序图 (Fig 5A/B/C) — CCN2 / SERPINE1 / TAGLN / COL1A1 (纤维化) + MT-ND1 / HMOX1 (线粒体) + ANGPT2 / ICAM1 / VWF (内皮激活) |
| 发现什么 | UW 组 HSCs CCN2/SERPINE1/COL1A1 显著上调 (纤维化启动);LSECs ANGPT2/ICAM1/VWF 显著上调 (内皮激活);HPG 组均接近基线 |
| 说明什么 | HPG 液在 HSCs + LSECs 中也显著优于 UW — 不只保护上皮,还抑制冷保存诱发的早期纤维化与血管激活,这是移植后纤维化与缺血-再灌注损伤的关键预防靶点 |
)
图 5 说明 (520 字): 图 5. 非实质细胞跨保存-复温时间线的转录动态。(A) 肝星状细胞 (HSCs) 纤维化/激活标志物 (CCN2、SERPINE1、TAGLN、COL1A1) - UW 组进行性上调, HPG 组接近基线。(B) HSCs 线粒体基因 (MT-ND1、HMOX1) - UW 组下降最陡。(C) 肝窦内皮细胞 (LSECs) 内皮标志物 (ANGPT2、ICAM1、VWF) - UW 组明显激活, HPG 组保持接近基线。
发现 4: UW 液扰乱细胞间通讯网络 (图 6 + 图 7)
做了什么: 用配体-受体推断 (Ligand-Receptor inference) 分析 5 实验组在 4 类细胞间的信号通讯强度。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 9 条配体-受体互作对 (PDO/HSC/LSEC/巨噬 间 GRM7/TLR2/ITGB3 等) + PAGA 细胞类型连通网络 (Fig 7B) |
| 发现什么 | HPG 组 5 条 GRM7 互作更强 (PDO→HSC, PDO→LSEC 等);UW 组 4 条 TLR2/ITGB3 互作更强 (巨噬细胞炎症激活);复温后 UW 选择性重激活 PDO + LSEC 信号通路,HPG 仅轻度激活 |
| 说明什么 | HPG 维持了更"生理性"的细胞通讯网络,而 UW 触发的是"损伤后炎症"网络;这与 Fig 4 转录组结论一致,双轴验证 HPG 优势 |
)
图 6 说明 (450 字): 图 6. 24 小时低温保存时的差异性配体-受体互作。UW 与 HPG 在 9 个 LR 对上的条形图 + 4 个条件 × 9 个 LR 对的点图, 显示 HPG vs UW 推断信号偏倚。HPG 组 GRM7 相关互作更强, UW 组 TLR2/ITGB3 相关互作更强。
)
图 7 说明 (480 字): 图 7. 低温保存以溶液依赖性方式重塑细胞间通讯网络。(A) UW 与 HPG 24h LR 互作偏倚条形图 - 5 个 GRM7 相关互作倾向 HPG, 4 个 TLR2/ITGB3 相关互作倾向 UW。(B) PAGA 细胞类型连通网络 - 静息态肝星状细胞/肝细胞/激活态肝星状细胞/巨噬细胞/肝窦内皮细胞。(C) 跨 4 个条件的配体-受体互作点图 - 颜色梯度绿-黄-蓝-紫 = 互作强度低到高。
💡 与 N 大代理产品的关联
4 维评分: ①方法直接使用 ②可迁移/互补 ③客户群刚需 ④产品差异点。已确认代理产品: Celvivo (ClinoStar/ClinoReactor) / Femtobiomed CellShot。
⭐⭐⭐⭐⭐ (5 星) 直接对标代理产品
| 代理产品 | 与本文方法的关系 | 评分维度 |
|---|---|---|
| Celvivo ClinoStar (旋转培养) | 本文用 类器官,但 Celvivo 未在本研究中使用。Celvivo 旋转培养可作为 PDOs 扩增的上游替代方案 (替代 Matrigel 静态扩增),让 PDOs 形态更均一 | ②③④ |
| Femtobiomed CellShot (分区流式电转染) | 本研究用 scRNA-seq 终点分析,但未做基因编辑/转染。CellShot 可作为 PDOs 基因编辑工具 (类器官 CRISPR 库筛选冷保存响应基因) | ②④ |
| Avatarget 12 孔 OoC | 本文用 Avatarget 苏州 国产 OoC 平台 — 虽不在代理清单,但国产化替代代表,客户场景可直接复现 | ①②③ |
⭐⭐⭐ (3 星) 可迁移/互补 (非代理, 出现在客户场景)
- Mimetas OrganoPlate (国际竞品, 灌流式 OoC) — 与 Avatarget 同赛道, 客户对比时需提示 Avatarget 优势是国产+价格
- Nanolive Eve (无标记实时成像) — 可作为冷保存过程的动态监测补充, 看类器官在 4°C 下的形态变化
客户对接话术 (实战脱敏版)
"贵方在做肝移植保存液筛选/类器官冷保存实验么? 我们的国产替代方案: ① Avatarget 苏州 12 孔 OoC 双腔室平台 + 多细胞共培养 (本文献已发表 Sci Rep 2026) + ② Celvivo ClinoStar 上游类器官扩增 + ③ CellShot 配套基因编辑筛库 — 全链条覆盖肝移植基础研究到临床前评价。"
🏷️ 结论
- HPG 液在 4 类肝细胞中均显著优于 UW 液 — 降低炎症 (IFI27/SAA1) + 线粒体应激 (MT-ND5) + 纤维化 (COL1A1/COL1A1) + 内皮激活 (ANGPT2/VWF) 4 大维度 (Fig 3 + Fig 4 + Fig 5)
- HPG 维持细胞间通讯网络更"生理性" — GRM7 介导的稳态信号保留,而 UW 触发 TLR2/ITGB3 介导的炎症通讯 (图 6 + 图 7)
- Avatarget 国产 OoC + scRNA-seq 是研究冷保存响应的稳健平台 — 9 例供体, 4 类细胞共培养, Harmony 整合 20,000+ 细胞
- HPG 候选下一代临床保存液 — 但本研究是体外 OoC 模型,需大动物 + 临床试验验证
- 国产 OoC 平台首次在国际期刊发表冷保存对比研究 — 客户场景的国产替代话术实证
📖 文献信息
| 字段 | 内容 |
|---|---|
| 标题 | Single-cell transcriptomic profiling reveals cellular stress responses to hypothermic preservation in liver-on-chip model |
| 第一作者 | Joseph Mugaanyi |
| 通讯作者 | Caide Lu |
| 期刊 | Scientific Reports (Nature Portfolio) |
| IF (2024) | 4.5 |
| DOI | 10.1038/s41598-026-50200-2 |
| PMID | 42069926 |
| PMCID | PMC13324284 |
| 发表日期 | 2026-04-20 Accepted, 2026 在线 |
| License | CC BY-NC-ND 4.0 |
| 数据可用性 | GEO 数据库 (S2 推断, 论文未注明) |
| 参考文献 | 50-60 篇 (DOI 验证: npj 2024 / Hepatology 2024 / Nature 2024 等) |
| 总页数 | 29 |
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|---|---|
| 原文 PDF | Sci_Rep_2026_Mugaanyi_liver_on_chip.pdf (Cloudreve 永久) (4.07 MB, %PDF-1.4, 有效期 2036-09-30) |
- 联系人: 李东伟｜📞 18045130660｜🌐 https://www.biokingdom.top
转发语: 🚨 肝移植保存液有重大突破:国产 Avatarget OoC + HPG 液, scRNA-seq 解析 4 类细胞, 全面优于 UW 金标准. 国产替代 + 国产保存液 + 国产 OoC, 三轴同时命中!