Biokingdom

完整 CelVivo 实验方案

ClinoStar 系统 + ClinoReactor 反应器 全流程操作 SOP

版本: v1.0 · 2026-08-24 · 基于 CelVivo 官方 21 份 Protocol + 11 份 Application Note + TDS 技术参数表整合

适用系统: CelVivo ClinoStar (含 ClinoStar 2 代) + ClinoReactor (10 mL disposable bioreactor)

目标读者: 客户 PI / 实验技术员 / 中间商技术支持

核心交付: 把分散在 32 份 CelVivo 官方文档里的所有操作步骤、转速表、试剂配方、风险点,整合成一份可以直接照着做的完整中文 SOP。

目录

  1. 系统概述 — ClinoStar 原理、剪切力优势、与 spinner flask 对比
  2. 设备与材料 — ClinoStar/ClinoReactor 规格、关键试剂清单、培养基配方
  3. 2D 细胞培养 — 2D 培养、冻存、传代 (HepG2/C3A 等贴壁细胞)
  4. ClinoReactor 准备 — 水化、超低粘附包被 (Biofloat)、平衡
  5. 球体/类器官生成 — 4 种方法 (单细胞悬液自组装 / 微孔板预聚集 / 海藻酸钠包埋 / VitroGel 包埋)
  6. 共培养与结构修饰 — LX-2 + HepG2 共培养、3D 包衣、增粘培养基
  7. 日常维护 — 换液、转速调整、传代、修整、转移、筛网分选
  8. 细胞系特异方案 — HepG2 mini-liver、肝毒理、甲状腺、SCLC、肺类器官、TNBC
  9. 下游分析 — ATP 法 (CellTiter-Glo)、Planimetry (FIJI)
  10. 维护与故障排查 — 常见失败模式、转速异常、污染处理

1. 系统概述

1.1 ClinoStar 工作原理

ClinoStar 是一个模拟微重力的细胞培养系统,通过低速倾斜旋转(clinostat motion)让 ClinoReactor (10 mL disposable bioreactor) 内的细胞处于持续自由落体状态。

核心物理参数:

1.2 与传统 spinner flask 的对比(核心优势)

参数 ClinoStar + ClinoReactor 传统 spinner flask
剪切力 0.01 Pa (超低) 0.3-0.66 Pa (高出 30-60 倍)
培养体积 10 mL / 个 50-500 mL
监控 6 个内置摄像头,实时成像 必须取样肉眼/显微镜观察
适用对象 原代细胞、敏感细胞系、长期培养 适应良好细胞系 (HeLa 等)
培养基用量 节省 5-10× 大量消耗

低剪切力的意义: 球体/类器官表面不会被流体剪切破坏,能形成完整的细胞-细胞连接 (tight junction / 紧密连接),这是肝细胞、甲状腺、肺类器官等恢复 in vivo 极性和功能的关键。

1.3 系统环境控制

环境参数 范围 精度
温度 6-30°C (高于室温 6°C 起) ±0.25°C
CO₂ 0-10% 标准培养用 5%
UV-C 灭菌 30 mA (内置 UV-LED) 每次清洁周期
电源 230V / 50Hz —
占地面积 小型,可叠 3 层 —

1.4 触屏控制

每台 ClinoStar 配一个 tablet,可控制多个 unit。

2. 设备与材料

2.1 主设备清单

设备 规格 备注
ClinoStar 主单元 6 反应器位, 1 套标配 包含 tablet 控制器
ClinoReactor 10 mL disposable, 一次性 独立无菌包装
加堆叠单元 可叠 3 层 = 18 反应器 选配
UV-C 灭菌模组 内置,自动运行 清洁周期
摄像头模组 6 个,5 MP 实时监控

2.2 试剂清单(按使用顺序)

2.2.1 2D 培养试剂

2.2.2 ClinoReactor 水化平衡试剂

2.2.3 自组装 / 聚集试剂

2.2.4 包埋试剂

2.2.5 共培养试剂

2.2.6 分析试剂

2.3 耗材清单

2.4 培养基配方

2.4.1 HepG2 / C3A 完全培养基(标准)

2.4.2 肝细胞完全培养基(用于 mini-liver / 肝毒理,见 §8.1)

2.4.3 肺类器官完全培养基(见 §8.5)

3. 2D 细胞培养

(基于 Protocol 002: Cultivating Cells in 2D)

3.1 贴壁细胞复苏与扩增

目的: 在转入 3D 培养前,先获得足够的、健康的 2D 单层细胞。

步骤

  1. 从液氮罐取出冻存管,立即 37°C 水浴解冻(1-2 分钟)
  2. 转移至 9 mL 预热的完全培养基中(15 mL 离心管)
  3. 离心 1000 RPM × 5 分钟,弃上清
  4. 用 10 mL 完全培养基重悬细胞
  5. 接种到 100 mm 培养皿,37°C / 5% CO₂ 培养箱
  6. 24 小时后换液,去除残余 DMSO 和未贴壁死细胞
  7. 每天观察,80% 汇合度 (confluence) 时传代

关键参数

细胞 汇合度传代 接种密度 倍增时间
HepG2 80% 1:3-1:4 24-30 h
C3A 80% 1:3 30-36 h
LX-2 80% 1:4 36-48 h
HMEC-1 70% 1:3 24 h
MCF7 80% 1:3 24 h
MCF12A 70% 1:3 20-24 h

3.2 2D 传代

  1. 弃旧培养基,加 5 mL DPBS 洗一次
  2. 加 1 mL 0.05% Trypsin-EDTA,37°C 消化 3-5 分钟
  3. 镜下确认细胞变圆脱落
  4. 加 9 mL 完全培养基终止消化,吹打均匀
  5. 离心 1000 RPM × 5 分钟
  6. 重悬,按比例接种新皿

3.3 冻存

  1. 取对数生长期细胞 (70-80% 汇合度)
  2. Trypsin 消化收集,离心
  3. 重悬于冻存液(90% FBS + 10% DMSO),密度 1×10⁶ cells/mL
  4. 1 mL/管,程序降温盒(Nalgene Mr. Frosty) -80°C 过夜
  5. 转入液氮罐长期保存

3.4 2D → 3D 转接入样前的细胞准备

关键准备(进入 §5 之前必须做):

3.5 2D 培养质控

指标 阈值 检测方法
活力 ≥90% Trypan Blue
支原体 阴性 月度 PCR 检测 (每月一次)
形态 正常 镜下观察,无空泡、颗粒化
增殖 稳定 连续 3 代倍增时间变异 <20%

---## 4. ClinoReactor 准备

(基于 Protocol 003 + 010: Preparation of ClinoReactor / Ultra Low Adherent ClinoReactor)

4.1 ClinoReactor 结构(8 个部件)

标签 名称 用途
A Top plug 顶塞(培养基加注/取出)
B Vents 通气孔(气体交换)
C Humidification chamber 加湿腔(装湿化珠)
D Petri dish lid 反应器上盖(可掀开)
E Cell culture chamber 细胞培养主腔(10 mL)
F Front port 前端口(细胞/球体接种/取出)
G Hydration port 加湿端口(注射无菌水水化)
H Feet 反应器支脚(可立放)

4.2 标准水化+平衡流程(无 Biofloat 包被)

总耗时: ≥6 小时(其中水化 4h + 平衡 2h)

前置: ClinoReactor 双层无菌包装, 在生物安全柜内操作, 所有接触材料的部件(顶塞、加湿塞)都不能碰裸手。

步骤

  1. 外层包装拆开, 内层包转至生物安全柜
  2. 拍几下让加湿珠(在 C 腔底部)聚集
  3. 反应器正面朝上放在平面上
  4. 从 G 端口注入 25 mL 无菌水(用 10 mL 注射器 + 针头刺穿内包装), 水化加湿珠
  5. 用胶带封住针孔(防止水分蒸发和污染)
  6. 正面朝上静置 ≥4 小时, 等加湿珠吸饱水
  7. 水化后的反应器 4°C 最多保存 10 天(仍在内层包装内)

平衡步骤

  1. 从内层包装取出, 竖立放
  2. 移除 A 顶塞, 加 6 mL 无菌水洗, 手动旋转涮洗, 抽出
  3. 重复洗一次
  4. 注入 6 mL 完全培养基(留 air cushion 顶空间隙), 塞回顶塞
  5. A 端口周围喷 200 µL 70% 乙醇消毒
  6. 放入 ClinoStar, 15 RPM 旋转 ≥2 小时
  7. 含培养基的反应器最多保存 3 天就必须用

4.3 Ultra Low Adherent ClinoReactor(生物浮力包被, 必读)

适用场景:

关键差异: 必须在加湿前包被培养腔(E), 加湿后包不匀。

包被流程(Biofloat FLEX)

  1. 生物安全柜内拆双层包装
  2. 取下顶塞(A), 加 5 mL Biofloat Clean Coating 溶液通过顶端口
  3. 反应器放入 ClinoStar, 15 RPM 旋转 5 分钟
  4. 抽出 Biofloat 溶液
  5. 加 5-6 mL 无菌水(可用 PBS/HBSS 替代)洗, 旋转涮洗, 抽出
  6. 重复洗一次

后续水化+平衡

与 §4.2 完全相同(加湿珠 + 平衡)。

4.4 关键避坑

坑 后果 修法
加湿珠未水化 4h 培养腔干燥, 细胞死亡 严格 ≥4h
Biofloat 在加湿后包 包被不匀, 细胞壁粘 改:先包后水化
没留 air cushion 没法排出气泡 顶塞下留 1-2 mL 空间
反应器包被后超过 3 天未用 培养基挥发/污染 现包现用, 当天用
针头刺穿 E 腔膜 反应器报废 务必小心, 只从 A/F/G 端口进针

5. 球体/类器官生成 — 4 种方法

5.1 方法 1: 单细胞悬液自组装 (Protocol 008)

适用: HepG2/C3A, INS-1E, 以及任何能自发聚集的细胞

优势: 最简单, 让 ClinoStar 自己干, 不需要预处理

步骤

  1. 准备单细胞悬液(从 §3.4 准备好的 2D 细胞)
  2. 血球计数, 活力 ≥90%
  3. 取平衡好的 ClinoReactor(§4), 从顶端口(A)抽掉培养基
  4. 加 5-6 mL 预温完全培养基
  5. 加 1×10⁶ cells 通过 A 或 F 端口(我们推荐 1M, 可优化到 0.5-2M)
  6. 如果从 F 端口加的细胞, 关 F 端口, 把反应器立起来
  7. 取下顶塞 A
  8. 缓慢加培养基补满(不搅动细胞) - 针头朝反应器壁, 让液流分散
  9. 过满到顶 collar 可见液面
  10. 轻拍反应器排气泡
  11. 塞回 A 顶塞, 吸走溢出培养基
  12. 小心旋转反应器检查还有无气泡, 没有则跳到 15
  13. 有气泡 → 反应器立起, 开顶塞, 用注射器吸走气泡
  14. 塞回顶塞, 再次检查无气泡
  15. 放入 ClinoStar, 启动旋转 (起始 RPM 见 §7.3 转速表)
  16. 48 小时后做首次换液(Protocol 004)

关键参数

参数 范围
接种密度 0.5-2×10⁶ cells / 反应器
起始 RPM 5-10 (见 §7.3 表)
首次换液时间 48 h
球体可见时间 1-4 天(达到 500 cells/conglomerate 时)

5.2 方法 2: 微孔板预聚集 (Protocol 009)

适用: HepG2/C3A, 以及对球体尺寸均匀度要求高的场景(药物筛选)

优势: 球体尺寸高度可控, 1000 cells/well 起

耗材

步骤

A. 板预处理 (前 1 天)

  1. 按厂家说明书预处理(包被+培养基平衡)
  2. 加新鲜培养基
  3. 离心 2000×g × 1 分钟 排空气泡
  4. 镜下确认无气泡, 有则重离心
  5. 37°C 培养箱预热待用

B. 接种聚集

  1. 准备单细胞悬液(§3.4)
  2. 计数 + 活力检测 ≥90%
  3. 推荐接种密度 ~1000 cells/well (按板优化)
  4. 加细胞到板孔, 100×g × 3 分钟离心
  5. 镜下确认细胞均匀分布
  6. 37°C / 5% CO₂ 培养箱 过夜聚集 (16-24 h)

C. 球体转移到 ClinoReactor

  1. 取平衡好的 Ultra Low Adherent ClinoReactor(§4.3), 抽掉平衡液
  2. 加 2-3 mL 预温培养基(通过 A 顶端口)
  3. 取下反应器 D 上盖, 露出培养腔
  4. 板从培养箱拿出, 微微倾斜, 用 1 mL 培养基温和冲洗微孔, 吹下球体
  5. 用宽口剪过的 P1000 tip 吸球体转入反应器
  6. 加 0.5 mL 培养基到剩余孔再冲一次
  7. 塞回 D 盖, 镜下看球体是否完整
  8. 镜下看板孔, 95-100% 球体已转移才算完成
  9. 反应器中观察球体, 移除团块/畸形聚集体
  10. 塞回 D 盖, 立起反应器
  11. 放入 ClinoStar, 按 §7.3 转速表启动

关键参数

参数 范围
接种密度 ~1000 cells/well (优化到 500-2000)
微孔板预处理 2000×g × 1 min 排气泡
预聚集时间 16-24 h (37°C, 5% CO₂)
转移效率 ≥95%
起始 RPM 8-15 (球体已成型, 比方法 1 高)

5.3 方法 3: 海藻酸钠包埋 (Protocol 014)

适用: MDA-MB-231 (三阴乳腺癌), 不易自发聚集的细胞, ECM 产量低的细胞

优势: 包被均匀, 产量高, ECM 仿生环境

试剂配方(提前配)

1% 海藻酸钠溶液 (w/v):

100 mM CaCl₂ 交联液:

(可选加蓝色染料 Erioglaucine E133 0.01% 便于观察 beads)

步骤

  1. 准备单细胞悬液(§3.4)
  2. 取 Ultra Low Adherent ClinoReactor (平衡好, §4.3)
  3. 细胞沉淀重悬在 1% 海藻酸钠溶液, 密度 5×10⁵ cells/mL
  4. 用 eLINE 多分液移液器(0.2-10 µL 多分液模式) + gel loading tip, 把海藻酸钠-细胞悬液分装到 ClinoReactor 内多个小滴(每滴 ~10 µL, 含 ~5000 cells)
  5. 小滴沉到反应器底部, 形成 beads
  6. 加 CaCl₂ 交联液覆盖 beads, 5 分钟(让海藻酸钠 beads 固化)
  7. 抽出交联液
  8. 用培养基洗 beads 2 次
  9. 加完全培养基(覆盖 beads), 10 mL 反应器约加 8-9 mL
  10. 放入 ClinoStar, 按 §7.3 转速表启动

关键参数

参数 范围
海藻酸钠浓度 1% (w/v)
CaCl₂ 浓度 100 mM
交联时间 5 min
细胞密度 5×10⁵ cells/mL (海藻酸钠内)
每滴体积 ~10 µL (~5000 cells/droplet)
Beads 数量 60-100 / 反应器
起始 RPM 5-8 (beads 比球体重, 转慢点)

5.4 方法 4: VitroGel 包埋 (Protocol 015)

适用: 与海藻酸钠类似, 但 xeno-free, 适合临床前/再生医学应用

优势: 无动物源成分, 比海藻酸钠更接近天然 ECM

试剂

步骤

  1. 准备单细胞悬液(§3.4)
  2. VitroGel 室温平衡 30 分钟
  3. Ultra Low Adherent ClinoReactor 平衡好(§4.3)
  4. 取 1.5×10⁶ cells 到 15 mL 离心管
  5. 离心收集细胞
  6. 按 VitroGel 厂家说明, 用 VitroGel 重悬细胞(密度优化, 厂家建议 1-5×10⁶ cells/mL gel)
  7. 用 eLINE 多分液 + gel loading tip 把 VitroGel-细胞分液到反应器内 (类似方法 3)
  8. VitroGel 在 37°C 自交联(无需额外交联液), 10-15 分钟固化
  9. 加完全培养基覆盖, 8-9 mL
  10. 放入 ClinoStar, 按 §7.3 转速表启动

关键参数

参数 范围
VitroGel 浓度 按厂家 (1:1 ~ 1:5 稀释)
细胞密度 1-5×10⁶ cells/mL (gel)
交联时间 10-15 min at 37°C
起始 RPM 5-8
优势 xeno-free, 临床转化友好

5.5 4 种方法对比选型

维度 方法 1 单细胞 方法 2 微孔板 方法 3 海藻酸钠 方法 4 VitroGel
操作复杂度 ⭐ 最简单 ⭐⭐⭐ ⭐⭐⭐⭐ ⭐⭐⭐
球体均匀度 ⭐⭐ 一般 ⭐⭐⭐⭐⭐ 最高 ⭐⭐⭐⭐ ⭐⭐⭐⭐
ECM 仿生 ❌ 无 ❌ 无 ✅ 海藻酸 ✅ xeno-free
适用细胞 自聚集型 大多数 不自聚集型 不自聚集型 + 临床
起始 RPM 5-10 8-15 5-8 5-8
成本 低 中(AggreWell 板) 低 高(VitroGel)

Robin 实战选型建议:

6. 共培养与结构修饰

(基于 Protocol 011 / 021 / 022)

6.1 共培养 (Protocol 011: Co-culture Constructs)

典型: LX-2 肝星状细胞 + HepG2/C3A 肝癌细胞, 9:1 比例

目的: 模拟肝纤维化微环境, 肝星状细胞被激活, 分泌 ECM, 让肝癌球体周围形成 fibrotic niche

步骤

  1. 分别准备 LX-2 和 HepG2/C3A 单细胞悬液(§3.4)
  2. 混合: LX-2 9 份 + HepG2/C3A 1 份, 总密度 1×10⁶ cells/反应器
  3. Ultra Low Adherent ClinoReactor(§4.3)
  4. 按 §5.1 方法 1 接种
  5. 第 7-10 天: 显微镜下观察 LX-2 是否已铺展在球体周围
  6. 培养 14-21 天可分析 fibrotic markers (α-SMA, collagen I)

其他共培养组合

组合 比例 应用
LX-2 + HepG2/C3A 9:1 肝纤维化模型
HMEC-1 + HepG2 5:1 血管化肝模型
MCF7 + MCF12A 1:1 乳腺肿瘤 vs 正常
NCI-H69V + 成纤维 5:1 SCLC 微环境

6.2 3D 包衣 (Protocol 021: Coating 3D Constructs)

目的: 防止球体之间粘连/融合, 保持单球体形态

适用

步骤

  1. 培养中的球体, 球体长到 200-400 µm
  2. 轻摇反应器, 收集所有球体到 15 mL 离心管
  3. 自然沉降 5 分钟, 弃上清
  4. 用低浓度海藻酸钠 (0.1%) 或透明质酸 (1 mg/mL) 重悬
  5. 室温孵育 5 分钟
  6. 加入 CaCl₂ (海藻酸钠) 或自然沉降(透明质酸)
  7. 重悬于新鲜培养基, 转回 ClinoReactor
  8. 继续培养, 球体表面形成薄包衣, 阻止融合

6.3 增粘培养基 (Protocol 022: Increasing Media Viscosity)

目的: 降低剪切力对敏感细胞的影响, 改善球体形成效率

试剂

配方

应用

细胞 MC 浓度 效果
原代肝细胞 0.3% 球体形成率 +40%
干细胞 0.5% 抑制沉降, 改善聚集
甲状腺类器官 0.1% 减少剪切损伤

7. 日常维护

7.1 换液 (Protocol 004: Media Change)

频率: 每 2-3 天一次(具体看细胞密度, SCLC 等快速增殖可每天)

步骤

  1. 准备预温的新鲜完全培养基(37°C 水浴)
  2. 取 10 mL 注射器 + 针头, 抽 5 mL 新培养基
  3. 反应器从 ClinoStar 取出, 立放
  4. 取下 A 顶塞, 缓慢注入 5 mL 新培养基(针头朝反应器壁, 不要直接冲细胞)
  5. 用另一支注射器从 A 端口缓慢抽 5 mL 旧培养基(等体积换液)
  6. 不要把培养基全部抽干, 留 5-6 mL 在反应器内
  7. 周围用 200 µL 70% 乙醇消毒, 塞回顶塞
  8. 反应器放回 ClinoStar, 调整转速

换液量参考

反应器体积 换液量 留存量
10 mL 5 mL 5 mL
5 mL (半装) 2.5 mL 2.5 mL

关键避坑

7.2 转速调整 (Protocol 012) — 核心

转速是 ClinoStar 系统最关键的参数, 直接影响球体大小、形态、长期稳定性。

调整原则

看图判断: 反应器旋转时, 球体在反应器内的位置必须是 "Optimal" (球体均匀悬浮, 不沉底不贴壁):

RPM 速查表(关键)

A. 单细胞悬液自组装路径 (Protocol 008 + 012)

Day RPM 范围 备注
0 3-6 接种后立即启动
1 5-10 可见小聚集
2 5-12 聚集明显
3 7-13 球体形成
4 7-15 球体长大
5 10-16
6 11-16
7 11-16
8 13-20
9 13-20 球体明显
10 15-21
11-14 15-22 平台期
15-23 16-25 长期维持

B. 微孔板预聚集路径 (Protocol 009 + 012)

Day RPM 范围 备注
0 (板) 0 (板里不动) 微孔板里过夜聚集
1 (转 ClinoReactor) 8-15 球体已成型, 起始更高
2-5 10-18 适应期
6-10 13-20 生长
11+ 15-25 长期维持

C. 海藻酸钠 / VitroGel 包埋路径 (Protocol 014 + 015)

Day RPM 范围 备注
0 5-8 beads 比球体重, 转慢点
1-3 6-10 适应
4-7 8-13 beads 内部细胞扩增
8-14 10-18 成熟
15+ 12-22 长期维持

调整时机

调整步骤

  1. 观察反应器内球体状态(摄像头或开盖肉眼)
  2. 看球体大小, 对照上面速查表
  3. 在 tablet 上调整 RPM(独立控制每个反应器)
  4. 等 5-10 分钟让流体惯量平衡
  5. 再次观察球体位置是否进入 "Optimal" 区域

7.3 传代 (Protocol 005: Splitting)

什么时候需要传代:

步骤

  1. 收集球体到 15 mL 离心管(反应器内培养基自然沉降, 或用宽口 tip 吸)
  2. 自然沉降 5 分钟, 弃上清
  3. 加 5 mL TrypLE Express, 37°C 消化 5-10 分钟(温和旋转混匀)
  4. 镜下确认: 球体解离成单细胞或小簇
  5. 加 5 mL 完全培养基终止消化
  6. 70 µm 筛网过滤(去除未解离团块)
  7. 离心 1000 RPM × 5 分钟
  8. 重悬, 计数, 活力检测
  9. 按 1:3-1:6 比例分到新反应器(用 Ultra Low Adherent ClinoReactor)
  10. 加培养基到 8-10 mL, 启动旋转(从 RPM 速查表的 Day 0 起步)

7.4 修整 (Protocol 006: Gardening)

目的: 移除形态异常(拉长、不规则、空泡)的球体, 保持培养群体质量

步骤

  1. 反应器放在立体显微镜下
  2. 用巴氏管或宽口 P1000 tip 选择性吸出异常球体
  3. 保留形态规则的球体继续培养

频率: 每周 1-2 次, 与换液同时

7.5 转移 (Protocol 007: Transferring)

目的: 把球体从旧反应器转到新反应器(例: 旧反应器包被降解, 或实验分组需要)

步骤

  1. 反应器内培养基+球体全部吸出到 15 mL 离心管
  2. 自然沉降 5 分钟
  3. 弃上清, 用新鲜培养基重悬球体
  4. 转入新平衡好的 ClinoReactor
  5. 加培养基到 8-10 mL, 启动旋转

7.6 筛网分选 (Protocol 013: Straining)

目的: 按球体大小分组(例: 100-200 µm 一组, 200-400 µm 一组)

步骤

  1. 收集所有球体到 50 mL 离心管
  2. 用 100 µm 筛网过滤, 收集通过部分(<100 µm)
  3. 用 400 µm 筛网过滤, 收集滞留部分(>400 µm)
  4. 中间 100-400 µm 部分按需收集
  5. 各组分别转入新反应器继续培养

8. 细胞系特异方案

8.1 HepG2 / C3A 迷你肝脏 (Protocol 101)

目标: 用 HepG2/C3A 在 ClinoStar 中重建 in vivo 肝功能

培养周期: 18 天恢复 in vivo-like 功能

培养基(肝细胞完全培养基)

关键参数

参数 值
接种密度 1×10⁶ / 反应器 (方法 1)
起始 RPM 5-8
培养周期 18 天 (功能分析)
功能指标 Albumin 分泌, CYP3A4 活性, urea 合成
首次换液 48 h

8.2 肝毒理 (Protocol 102)

应用: 药物肝毒性筛选

试剂

流程

  1. HepG2 球体培养 14 天(已建立肝功能)
  2. 加药物处理 24-72 h (5 个浓度梯度, 3 复孔)
  3. 收集球体到 96 孔板, 加 CellTiter-Glo 3D
  4. 裂解 30 分钟, 发光读数
  5. IC25 / IC50 计算

关键参数

参数 值
药物处理时间 24-72 h
浓度梯度 5-7 点 (10 nM - 100 µM)
读数方法 荧光/发光 (ATP)
复孔数 ≥3
阳性对照 Acetaminophen (APAP, 5-10 mM)
阴性对照 0.1% DMSO

8.3 甲状腺 (Protocol 103/104)

细胞: FTC133 (甲状腺癌), Nthy-ori (正常甲状腺)

关键参数

参数 值
接种密度 1×10⁶ / 反应器
起始 RPM 5-10
培养周期 21 天
培养基 RPMI 1640 + 10% FBS + 1% P/S

8.4 小细胞肺癌 (Protocol 105: NCI-H69V SCLC)

应用: SCLC 临床前模型, 对伊立替康(irinotecan) 敏感

关键参数

参数 值
接种密度 1×10⁶ / 反应器 (1×10⁵ cells/mL × 10 mL)
起始 RPM 8.0-8.5
维持 RPM 8-9 (固定, 不需大幅调整)
培养基 RPMI 1640 + 10% FBS + 1% NEAA + 1% P/S + 2 mM L-glutamine + 25 µg/mL 抗坏血酸
维持培养基 同上 + 5 µg/mL 抗坏血酸
换液频率 每 2 天
球体大小筛选 21 天后筛网分选

验证指标

药物响应

8.5 肺类器官 (Protocol 106: HUB Lung Organoids)

细胞来源: HUB Organoids (hubrecht institute) — 上/下呼吸道类器官

培养基配方(50 mL)

Basic Medium (500 mL):

Complete Organoid Growth Medium (50 mL):

试剂 量
Basic medium 38.421 mL
R-spondin cond. medium 5 mL
Noggin cond. medium 5 mL
B27 (50×) 1 mL
Nicotinamide (1 M) 250 µL
NAC (500 mM) 125 µL
A83-01 (500 µM) 50 µL
SB 202190 (30 mM) 1.7 µL
FGF-7 (25 µg/mL) 50 µL
FGF-10 (100 µg/mL) 50 µL
Primocin (50 mg/mL) 50 µL
Y-27632 (100 mM, ROCK inh.) 5 µL

流程

  1. TrypLE 解离: 5 min at 37°C, 吹打, 1250 RPM × 5 min
  2. 重悬转入 ClinoReactor(顶端口, 确保无气泡)
  3. 70% 乙醇消毒端口
  4. 放 ClinoStar, 按球体大小调 RPM
  5. 换液: 每周 2 次, 每次 5 mL(顶端口换液)

关键

8.6 三阴乳腺癌 TNBC (Protocol 110)

细胞: MDA-MB-231 (HTB-26, ATCC)

关键指标

培养时间线

Day 事件
7 早期球体
14 成熟球体
21 长期培养, 表达分析

推荐方法

8.7 其他共培养 (Protocol 107/108/109)

组合 应用 关键比例
MCF7 + MCF12A (107) 乳腺肿瘤 vs 正常 1:1
Alginate-TNBC (108) TNBC 包埋 海藻酸钠
HepG2 + HMEC-1 (109) 血管化肝 5:1

9. 下游分析

9.1 ATP 活力检测 (Protocol 102)

应用: 球体活力定量, 药物 IC50 计算

试剂

步骤

  1. 反应器取出, 收集球体到 96 孔白板(每孔 1-5 个球体)
  2. 加 100 µL CellTiter-Glo 3D + 100 µL PBS (1:1)
  3. 振荡裂解 30 分钟(球体需时间裂解, 比 2D 慢)
  4. 室温平衡 10 分钟
  5. 发光读数 (luminometer)

关键参数

9.2 活/死染色

试剂

步骤

  1. 球体收集到 96 孔板
  2. 加 100 µL 染色工作液
  3. 37°C 避光孵育 30-60 分钟(球体渗透慢)
  4. 共聚焦显微镜 z-stack 扫描(球体厚度 100-300 µm)

9.3 Planimetry — FIJI 球体尺寸测量 (Protocol 111)

应用: 球体表面积/直径定量, 用于药物处理后形态学变化分析

步骤

  1. 拍摄球体图像

    • 反应器放在立体显微镜下
    • 或取出球体到培养皿, 倒置显微镜 4× 物镜
    • 标准化光照/曝光

  2. FIJI (ImageJ) 测量

    • 打开图像 → Image → Type → 8-bit
    • Image → Adjust → Threshold → 调阈值覆盖球体
    • Analyze → Analyze Particles → size 50-1000 µm², circularity 0.5-1.0
    • 导出每个球体的 Area, Perimeter, Feret diameter

  3. 数据处理

    • 计算平均表面积(µm²)
    • 球体直径 = 2 × √(Area / π)
    • 球体体积 ≈ 4/3 × π × r³

关键参数

参数 值
阈值方法 Otsu 或手动
最小尺寸 50 µm²
复孔数 ≥10 个球体 / 条件
时间点 Day 0, 3, 7, 14, 21

9.4 组织学 / 免疫荧光

石蜡切片

  1. 球体收集到 4% PFA, 固定 1 h
  2. 琼脂糖包埋(防止球体散)
  3. 石蜡包埋, 切片 5 µm
  4. H&E 染色或免疫组化

冰冻切片

  1. 4% PFA 固定 1 h
  2. 30% 蔗糖脱水过夜
  3. OCT 包埋, 切片 10 µm
  4. 免疫荧光染色

9.5 qPCR / RNA-seq

RNA 提取

关键基因 panel (按细胞系)

细胞系 推荐基因
HepG2 (肝) ALB, CYP3A4, CYP2B6, HNF4A, TDO2
NCI-H69V (SCLC) ASCL1, NEUROD1, MYC, CHGA
MDA-MB-231 (TNBC) MUC1, CDH2, CD44, CD24, VIM
FTC133 (甲状腺) TPO, TG, TTF1, PAX8

10. 维护与故障排查

10.1 常见失败模式

症状 原因 修法
球体沉底, 粘连 RPM 太低 按 §7.2 表上调 RPM
球体贴反应器壁 RPM 太高 按 §7.2 表下调 RPM
球体大小不一 自发聚集随机 改方法 2 微孔板预聚集
球体融合成大团 高 ECM 产量细胞 加 §6.2 包衣或 §6.3 增粘
反应器污染 操作污染 重做, 严格无菌
球体中央坏死 球体太大 (>400 µm) 缩短培养周期, 或传代
球体不形成 细胞活性差 2D 培养活力复测, 重新冻存/复苏
RPM 调整后球体位置不变 RPM 变化太小 每次 ±2 RPM 调整

10.2 转速异常诊断

现象 检查 修法
反应器不转 电机故障 / 端口没塞紧 检查 ClinoStar 状态, 重新装
反应器抖动 装载不平衡 6 个反应器对称装载
球体忽快忽慢 加湿珠干燥 检查 C 腔湿度
RPM 设置无反应 Tablet 连接断开 重启 tablet WiFi

10.3 污染处理

细菌污染

真菌污染

支原体污染

10.4 反应器失效处理

失效 诊断 修法
顶塞漏气 培养基蒸发快 换新顶塞(配件)
E 腔膜破损 培养基渗漏 换新反应器
加湿珠干燥 球体生长异常 重做水化步骤
端口堵塞 注射器推不动 用针头通, 不要用力

10.5 ClinoStar 设备维护

每日

每周

每月

10.6 安全与法规

附录 A: 关键数字速查卡

设备

试剂关键浓度

时间节点

细胞密度

RPM 速查(3 种方法)

附录 B: 全部协议来源

本 SOP 整合自以下 CelVivo 官方文档(evidence/chunks/):

21 个 Protocol (O01-O22):

11 个 Application Note:

产品资料:

文档版本: v1.0 · 完成日期: 2026-08-24 · 整合: AI Agent (Robin ITX)
对接: 汇佰生物 (huibaibio) / 9X Bio · CelVivo 中国区技术支持