急性脑切片、球泡与类器官的电生理活动测量：3D 高密度微电极阵列 (3D HD-MEA) 标准化协议

Measuring Electrophysiological Activity in Acute Brain Slices, Spheroids, and Organoids Using 3D High-Density Multielectrode Arrays

Pali, E., Pellavio, G., Conforti, M., Sarkissian, A. A., Aliya, B., Sciacca, G., Wariyar, S. S., Mainardi, F., Tedesco, M., Verduci, I., Cadiao, G., Cervetto, C., Andersen, J., Birey, F., Maccione, A., D'Angelo, E., & Mapelli, L. (2026). Bio-protocol 16(11): e5708. DOI: 10.21769/BioProtoc.5708

📣 摘要

3D 生物模型 (动物/人类干细胞来源的脑切片、球泡与类器官) 已成为体外电生理学的关键平台，因为它们能通过空间架构特征重现体内条件，比 2D 模型更贴近体内。然而，传统平面 MEA (数十个电极) 在用于 3D 模型时遇到四大局限：标本与芯片粘附有限、传感元件数量不足、无法捕获组织内层信号、组织与传感器接触时灌注与活力下降。本协议 (Pali et al., 2026) 提供了一套基于 3Brain 3D HD-MEA (CorePlate 3D 1W 38-60-90) 平台的标准化电生理记录工作流，覆盖：(1) 小鼠小脑、前额叶、皮层-海马区急性切片；(3) 人源/动物源脑球泡；(3) 皮层与脊髓类器官。协议重点解决：① 不同脑区切片的具体调整；② 高效耦合切片与芯片；③ BrainWave6 软件的数据采集、信号检测与分析流程。关键技术包括 90 μm 高的三维微柱阵列 (64×64 矩阵，60 μm 电极间距)、微通道结构维持组织活力、可调节 sample holder 压力 (500-1250 μN)。

🔬 研究背景

3D 脑模型是研究神经生理与病理活动的金标准。动物模型提供成熟且结构准确的脑回路架构，对研究功能与疾病中的电活动至关重要；人源 hiPSC 来源的神经类器官与人脑球泡可重现独特的人类特征，且可长期培养 (长达数年) 支持多深度神经发育研究，并可生成多样化的细胞类型 (皮层、丘脑、脊髓细胞)，功能成熟度高于 2D 培养。

研究神经活动的技术包括膜片钳、钙成像与多电极阵列 (MEA)。其中 MEA 是表征 3D 模型电生理活动的理想技术，能非侵入式同时多点记录、保持单细胞分辨率，且近期引入的高密度 MEA (HD-MEA) 提供优秀空间分辨率。然而传统平面探头对 3D 模型存在局限：

针对上述问题，新一代 3D HD-MEA 在芯片基底集成三维电极穿透组织，同时装备微通道维持灌注与药理学测试效率。该技术对神经发育、神经药理学、神经病理学等领域的回路功能-结构关系研究有重要意义。本协议面向不同 3D 模型 (小脑、前额叶、皮层-海马急性切片、脑球泡、皮层与脊髓类器官) 提供标准化操作流程。

🧪 实验方法

设备

实验对象

处理流程

协议分两大部分独立运行：Part I: 急性脑切片 与 Part II: 脑球泡与神经类器官。每部分包含：① 试剂与溶液配制 → ② 切片/球泡/类器官制备 → ③ 3D HD-MEA 样品架装配 → ④ 样本安装 → ⑤ 数据采集 → ⑥ 数据分析 → ⑦ 故障排除。关键步骤：切片在 95% O₂/5% CO₂ 混合气饱和的 Krebs/mACSF 溶液中制备与维持；sample holder 压力根据样本尺寸调整 (球泡 ~400/500 μm 用 1250 μN，球泡 ~1000/1200 μm 用 750/1000 μN，类器官 ~1000/1700 μm 用 750 μN，类器官 >1700 μm 用 500 μN)；记录前让样本在 37℃ 培养箱环境控制盒内沉降 5-10 min。

分析方法

📊 核心结果与配图

发现 1：3D HD-MEA 平台整合了高密度电极、微通道与样品架系统

做了什么：在 64×64 矩阵上集成 90 μm 高三维微柱阵列 (电极间距 60 μm)，并在基底设计微通道结构；同步开发可调节 sample holder (500-1250 μN 四档) 与 BrainWave6 软件分析栈。发现什么：microplate SD ≤14 μV (100 Hz 高通)，表明芯片底噪在电生理可检测阈值以下；样品架压力按样本尺寸可分级 (球泡 ~400/500 μm 用 1250 μN，球泡 ~1000/1200 μm 用 750/1000 μN，类器官 ~1000/1700 μm 用 750 μN，类器官 >1700 μm 用 500 μN)。说明什么：该平台同时解决了四个传统平面 MEA 的局限 (标本粘附、有限传感元件、组织内信号缺失、活力下降)，使 3D 模型可在维持活力的状态下进行高密度电生理记录。

发现 2：急性切片在不同脑区需要不同的高通滤波设置

做了什么：在小脑、前额叶、皮层-海马区三个脑区的急性切片上分别测试 100 Hz 与 5-20 Hz 两种硬件高通滤波截止频率的信号质量。发现什么：小脑切片用 100 Hz 截止频率有效隔离快峰并稳定基线；前额叶与皮层-海马切片需 5-20 Hz 截止频率以保留慢场电位与峰叠加 (避免高通过滤在低频段衰减信号)，同时记录快峰。说明什么：不同脑区的信号时域特征不同 (小脑快峰占比高，皮层/海马慢场电位占比高)，单一滤波方案不适用；硬件高通滤波设置需按脑区调整以避免信号衰减或基线漂移。

发现 3：3Brain Sample Holder 2 系统支持标准化样品装配

做了什么：开发 Sample Holder 2 (frame + insert + silicone net 三组件) 用于切片/球泡/类器官的标准化装载；提供 Handling Tool 用于无菌操作；样品架硅胶网可重复使用。发现什么：样品架压力按样本尺寸分级 (1250/1000/750/500 μN 四档)，对不同尺寸球泡与类器官均能稳定接触；过多缓冲液通过 silicone net 排出避免组织缺氧；样品架插入后在 35 mm Petri 皿中用 PBS 水化处理可去除硅胶网内残留气泡 (见 Figure 13)。说明什么：标准化样品架系统消除了传统手工装载的位置不稳定问题，使多类 3D 模型可在同一 3D HD-MEA 芯片上标准化记录。

发现 4：BrainWave6 软件支持图像叠加与通道选择用于精确解剖识别

做了什么：使用 IC Capture 软件拍摄切片明场图像，并通过 BrainWave6 的 "Overlay and Annotations" 功能将图像叠加在 3D HD-MEA 通道图上；通过 "Chip Pilot" 设置硬件高通截止频率。发现什么：通过将切片图像与通道图叠加，可精确定位每个电极对应的解剖区域 (皮层-海马区 (A)、小脑 (B))，便于后续数据按解剖区域分别提取；脑切片在芯片上稳定定位避免了切片漂移带来的解剖错位。说明什么：图像叠加是 3D HD-MEA 数据分析的关键第一步，它将 4096 通道的空间分辨率映射到具体的解剖结构，让后续 spike sorting 与 burst detection 按区域独立进行。

发现 5：3D HD-MEA 在急性切片上记录到典型的局部电生理活动图谱

做了什么：在小脑 (A)、皮层-海马 (B)、前额叶 (C) 三种急性切片上使用 3D HD-MEA 记录自发活动，并通过 BrainWave6 生成活动图谱与原始 trace。发现什么：三种切片呈现不同空间活动模式：小脑切片呈现局部致密爆发活动；皮层-海马切片呈现海马区与皮层区分层活动；前额叶切片呈现多个解剖层级的同步活动。trace 显示出 spike train 特征，包括 bursting 与 single-cell firing 模式。说明什么：3D HD-MEA 的 4096 通道 + 60 μm 间距 + 90 μm 微柱能够捕获急性切片不同脑区的空间与时域电生理特征，为研究脑回路动态提供了高分辨率工具。

发现 6：球泡形成过程的可视化与培养时间-形态关系

做了什么：在 Day 1、Day 7、Day 14 三个时间点对大鼠皮层神经元 (A) 与 hiPSC 衍生神经元 (B) 的球泡形成进行明场成像记录。发现什么：Day 1：24 h post-seeding 起始自发细胞聚集，聚集周围可见早期聚集细胞，死细胞通过重复换液清除；Day 7：完全形成的球泡，球形形态清晰；Day 14：成熟球泡，呈现球形形态与先进结构组织。比例尺：1,000 μm。说明什么：球泡形成经历三个明确阶段：起始聚集 (Day 1) → 完全形成 (Day 7) → 成熟结构化 (Day 14)，这三个时间点为球泡类电生理记录提供了标准化窗口。

发现 7：3D HD-MEA 在脑球泡与神经类器官上的标准化装载流程

做了什么：使用 cut-tip P200 pipette 将球泡从 96 孔低吸附板收集到 Petri 皿；通过 sample holder 装载到 3D HD-MEA；在 mini-incubator box 内维持 5%-10% CO₂/空气环境；37℃ 温控由 BrainWave6 控制。发现什么：球泡 (400-500 μm) 用 1250 μN 样品架；球泡 (1000-1200 μm) 用 750-1000 μN；类器官 (1000-1700 μm) 用 750 μN；类器官 (>1700 μm) 用 500 μN。记录前样本在环境控制盒内沉降 5-10 min 以稳定电极耦合。说明什么：标准化装载流程消除了传统手工操作的差异性，使不同尺寸球泡与类器官均能在 3D HD-MEA 上获得稳定的电生理记录。

发现 8：3D HD-MEA 在脑球泡上记录到自发活动与活动图谱

做了什么：在三个不同尺寸的脑球泡上同时进行 3D HD-MEA 记录，生成原始电压 trace (左) 与 peak-to-peak 活动图谱 (右)。发现什么：每个球泡分配一个 color-coded channel；三个球泡呈现不同的发放模式 (大球泡 vs 小球泡)；活动图谱显示球泡内不同区域的活动强度差异。说明什么：3D HD-MEA 可同时记录多个球泡的电生理活动，并保留每个球泡的空间信息，为高通量球泡电生理分析提供了工具。

发现 9：3D HD-MEA 在皮层与脊髓类器官上记录到自发活动

做了什么：在 80-day 培养的皮层类器官与 30-75 day 培养的脊髓类器官上使用 3D HD-MEA 记录自发活动；分析代表性 spike 波形 (左) 与活动图谱 (右)。发现什么：皮层类器官 (80-day) 呈现成熟的网络活动模式；脊髓类器官 (30-75 day) 呈现不同发育阶段的活动特征。说明什么：3D HD-MEA 可在不同发育阶段对类器官进行电生理记录，结合 spike sorting 与 burst analysis 可揭示类器官发育过程中网络活动的成熟轨迹。

发现 10：标准化故障排除流程解决了 3D HD-MEA 实验中的常见问题

做了什么：在 Protocol 中明确列出 9 个常见问题与解决方案 (Problem 1-9)，覆盖：电生理信号微弱、切片/球泡死亡、芯片通道噪声、气泡干扰、活动信号稀疏、电极损伤等问题。发现什么：Problem 7 (视觉检查无可检测活动) 通过重新定位样本、增加 sample holder 压力、药物干预 (电刺激或药理学) 可解决；Problem 8 (空间受限活动) 通过重新定位样本或多次记录不同朝向可解决；Problem 9 (意外电极上检测到 active units) 通过 Batch Processing 后 Event Post-Processing 模块移除伪迹 spike。说明什么：标准化故障排除流程降低了 3D HD-MEA 实验的学习曲线，使研究人员能够独立解决常见问题，提高实验的可重复性与可比性。

💡 与可应用的产品

本协议是 3Brain AG (Switzerland, 厂家已对接) 3D HD-MEA 平台 (CorePlate 3D 1W 38-60-90) 与 BioCAM DupleX 记录系统的官方一手标准化 SOP。论文方法在 3Brain 平台上的具体应用维度：

🏷️ 结论

1. 平台创新：3Brain 3D HD-MEA 平台通过 90 μm 高三维微柱、64×64 矩阵 (60 μm 电极间距)、微通道结构、可调节样品架压力 (500-1250 μN) 解决了传统平面 MEA 在 3D 模型上的四大局限 (标本粘附、有限传感元件、组织内信号缺失、活力下降)。
2. 协议覆盖完整：本 SOP 提供了从切片制备、球泡形成、类器官培养、芯片装载、数据采集到分析的端到端工作流，覆盖 7 种 3D 模型 (3 个脑区急性切片 + 大鼠/人源球泡 + 皮层/脊髓类器官)。
3. 关键技术：硬件高通滤波截止频率按脑区调整 (小脑 100 Hz，皮层/海马 5-20 Hz)；Spike Detection 算法按脑区选择 (PTSD vs 硬阈值)；图像叠加用于将 4096 通道映射到解剖结构；标准化样品架装配 (气泡去除、压力选择、位置调整) 提高了实验可重复性。
4. 作者自陈局限：(1) 3D HD-MEA 记录受生物和技术变异源双重影响，用户需根据自身实验系统评估每个因素的贡献；(2) 类器官在尺寸、形态、细胞架构上具有内在异质性，电极覆盖、信号幅度、活跃通道数随发育时间变化显著；(3) 不同 iPSC 系、类器官区类型、批次、记录条件下 spike burst 与网络 burst 的存在与频率差异显著。
5. 下一步方向：(1) 在 3D HD-MEA 平台上开发自动化 spike sorting 与 burst detection pipeline 以减少人工干预；(2) 在更长培养时间 (>210天) 类器官上验证 3D HD-MEA 的稳定性与可重复性；(3) 将 3D HD-MEA + 球泡形成回路的范式推广到更多脑区类器官 (如纹状体、基底节等);(4) 结合药物干预 (TTX、gabazine 等) 在 3D 模型上构建高通量药理学筛选平台。

📖 文献信息

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转发语: 3Brain 这篇 Bio-protocol 5708 SOP 给所有做 3D 模型电生理的人铺好了路——从切片/球泡/类器官到 3D HD-MEA 芯片装载、BrainWave6 数据分析、9 个常见故障排除，全链路标准化。90 μm 高三维微柱穿透组织保留活力，4096 通道捕获脑区级网络动态，最关键是厂家 4 位作者直接参与 (Verduci 等)，客户拿到手就是 3Brain 官方标准。🧠⚡